J'ai vu le post d'ondine l'année dernière, mais j'ai du mal a capter un truc. Je vous le remet pour vous éviter l'ouverture de trop de fenêtre :p .
-> Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)
Son objectif c’est de savoir, quel type de nucléosome (et quel type DE MODIFICATION D'HISTONES) est présent sur quel endroit du génome.
Par exemple, on veut voir les gènes qui sont exprimés en sélectionnant les méthylations en K4 de H3 car on sait que cette modification des histones est associée à l'activation de l'ADN
On va pouvoir cartographier les modifications d'histones (= de la chromatine) sur l'ADN (=code des histones)
1. On part de la cellule (et pas de l’ADN) et on fige la cellule (c’est très classique) forme des liaisons covalentes protéines-protéines et ADN-protéines grâce au formaldéhyde Ceci est réversible en modifiant la température.
2. On achète/génère des anticorps spécifiques d'une modification d'histones (exemple une méthylation / acétylation d'une lysine/arginine sur H3/H2 ...) . Les nucléosomes (formés par les histones) sont différents car il ont subit des modifications POST-TRADUCTIONNELLES différentes.
3. On fait une immunoprécipitation. On crée des complexes immuns spécifiques (notre anticorps + la modification de la chromatine associée).
ICI C'EST LE POINT DELICAT : On va récupérer l'ADN associée à sa chromatine QUI A PRECIPITE ! Donc seulement l'ADN qui possède la chromatine qui possède la modification qu'on recherche. Ce qui ne précipite pas est retiré ! (on élimine le surnageant).
Donc à ce moment, on se retrouve avec des fragments d'ADN + chromatine qui possèdent TOUS (au moins une fois sur le fragment, pas forcément tous les nucléosomes du fragment) la modification d'histones qu'on a sélectionné. C'est pour cela qu'on dit que notre ADN est ENRICHIT en modification K4H3.
Proportionnellement la quantité de modification K4H3 sur notre ADN (après immunoprécipitation) est beaucoup plus grande, on a par exemple 90 % de la chromatine qui a la modification, alors qu'avant c'était 20 % (à ce moment on avait TOUT l'ADN, on en avait pas viré la moitié par l'immunoprécipitat)
4. On reverse le pontage et on purifie l’ADN (on enlève les anticorps). On s'aperçoit que l’ADN est de composition différente comparé à l’ADN contrôle avant l’immunoprécipitation (= InPut).
On regarde après l’immunoprécipitation, ce qui a été enrichit : ce sont les fragments d’ADN qui ont la modification recherchée sur les nucléosomes
On sélectionne DE l’ADN À PARTIR de modifications DES NUCLEOSOMES. On sélectionne la modification nucléosomale qu’on veut, et à partir de ça, on récupère l’ADN qui a de la chromatine qui porte cette modification.
Comment visualiser cet ADN ?
-> On peut faire par hybridation, avec une sonde contre cette région, et on regarde après hybridation si la sonde est enrichit dans l’immunoprécipat par rapport à l’input
Exemple : On a le gène de la ß-globine, on veut s'avoir si il s'exprime, et on sait que la chromatine doit porter une modification K4H3 pour que le gène soit exprimé. On fait l'immunoprécipitation.
On prend l'ADN après immunoprécipitation : on envoie la sonde fluorescente qui correspond à la séquence du gène de la ß-globine
On prend l'ADN contrôle (InPut), on fait la même chose
Si la fluorescence est la même dans les 2 cas, c'est que ce gène n'a pas été enrichit
-> Par la réaction PCR, qui permet d’amplifier des séquences spécifiques d’ADN, qu’on peut rendre quantitatif, et permet de déterminer très précisément la quantité d’ADN enrichit. Ceci implique qu’on connaisse la région qui nous intéresse. Parfois on ne le sait pas, ce qui nous intéresse ce sont des profils globaux au niveau du génome
-> On peut avec nos machines de séquençage séquencer le génome, on séquence l’immuno-précipitat par rapport à l’Input. C’est une méthode : le Chip-Sec (combinaison Chip et séquençage haut débit)
-> On peut exprimer un rapport Rip.
Rip = Quantité du fragment PCR qui nous intéresse DANS L’IMMUNOPRECIPITAT / quantité totale d’ADN de la réaction
Donc plus la modification qu’on a sélectionné dans notre ADN est répendue, plus le rapport va être grand.
Un autre rapport
Rc = Q fragment PCR qui nous intéresse (LE MEME) DANS L’INPUT / quantité totale d’ADN de la réaction
On a un enrichissement si Rip > Rc
On parle d’un facteur d’enrichissement = Rip / Rc
C'est exactement pareil que pour l'exemple de la ß-globine. On va prendre un truc plus concret.
- L'ADN c'est les 1000 étudiants en P1 = l'ADN TOTAL
Dedans, il y a 550 filles. Les filles c'est le fragment PCR = la modification qu'on recherche
Donc on peut déjà faire le Rc = 550 / 1000 = 0,55
On envoie "un anticorps" qui sélectionne quelque chose que portent toutes les filles. Et on vire tous les autres (donc tous les mecs). Comme certaines filles sont en couples, elles viennent avec leur mec.
C'est pour cela qu'à la fin on a environ 600 personnes, dont les 550 filles.
Là, on peut exprimer le rapport Rip Rip = 550 / 600 = 0,92
Le facteur d'enrichissement = 0,92 / 0,55 = 1, 72
On a un facteur d'enrichissement supérieur à 1. Donc ça veut dire que l'anticorps qu'on a envoyé sélectionne bien mieux les filles que les garçons.
OU : L'anticorps qu'on a envoyé reconnait mieux la chromatine portée par le gène d'intérêt que la chromatine du reste de l'ADN.
Voila mon problème est au niveau de l'exemple avec les étudiants..
D'apres les formules du Rip et du Rc, on devrait avoir le meme dénominateur, et ce n'est pas le cas dans cet exemple donc ça glisse pas.. Quelqu'un pourrait m'aider ?? Merci
