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[En discussion]Immunoprécipitation

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[En discussion]Immunoprécipitation

Messagepar Léa_ » 22 Nov 2012, 11:52

Salut !

J'ai vraiment un souci avec cette expérience, je ne COMPRENDS pas.

Toute la manip, ok, j'ai compris. Mais c'est le but de cette expérience que j'ai du mal à voir. Je vous dis ce que je pense comprendre et vous me dites ce qui va pas ;)

:arrow: On cherche, sur une région d'ADN, une modification des histones. OK
:arrow: On met nos petits anticorps qui nous sélectionnent les régions avec la modification -> Immunoprécipitat. OK
:arrow: On vire les Ac de cet immunoprécipitat et on enrichit l'ADN :idea: Question n°1 : qu'est ce que ça veut dire "on enrichit " ? Est ce que par exemple on les marque à la radioactivité, ou quelque chose qui nous permettra de reconnaitre la séquence ?
Donc d'après moi, à ce niveau là, tout l'immunoprécipitat est enrichit (puisqu'on avait dedans que les régions d'ADN collées à des histones qui avaient notre modification).
:arrow: Ensuite on fait une PCR :idea: Question n°2 : POURQUOI ? Si on augmente la quantité de fragment enrichi, ça va fausser le rapport ensuite quand on le comparera avec notre séquence d'ADN étudiée initiale non ? A moins qu'on amplifie aussi la séquence d'ADN initiale pour conserver le rapport ?
:arrow: Enfin, on regarde les rapports :
- Rip : quantité du fragment qui nous intéresse dans l'immunoprécipitat : :idea: Question n°3 : ca devrait être égal à 1 non ? Puisqu'on a enrichi notre ADN d'immunoprécipitat, qu'on l'a ensuite amplifié... D'après ce que j'ai compris, on amplifie tout notre immunoprécipitat ?
SUR la quantité totale d'ADN de la réaction, là, c'est la région d'ADN à laquelle on s'est intéressée au début :idea: Input donc ?
:idea: Question n°4 : en fait ce rapport est censé nous montrer quelle est la quantité d'ADN de notre région qui possède la modification (dont les histones blablabla, je fais un raccourci, je sais que c'est pas l'ADN qui est modifé ;) )
Ce que je ne comprends pas là c'est comment on va déterminer ce rapport à partir de l'expression qu'on nous donne, pour moi ça devrait être : Immunoprécipitat / Qté d'ADN du début, et cette quantité, c'est l'InPut non ?
- Rc : alors là ça ne va plus du tout, je ne vois pas comment on peut sélectionner la région qui a été enrichie: on hybride notre région enrichie, on fait une sonde à partir de ça et on regarde ou elle va se fixer sur l'InPut ? Du coup on obtient le Rip ?
Ensuite on compare la présence de cette modification dans l'Input sur la qantité totale du génome :idea: Pourquoi ?

Je pense que je dois faire fausse route à de nombreux endroits, alors merci de m'éclairer un peu et me remettre sur le droit chemin (ahah).
PS : j'ai lu les post de l'an dernier dessus, donc pas la peine de me donner un lien vers un ancien post, ça m'aide pas vraiment :S

:bye:

EDIT : Pour synthétiser, parce que je veux ben croire que répondre à chaque question n'est pas facile, j'aurais besoin d'explications sur :
:arrow: Qu'est ce que l'enrichissement de l'ADN ?
:arrow: Les rapports Rip et Rc : comment on arrive à les avoir (voir mon post plus bas), à quoi ils correspondent ?

Re-Merci :embarrassed:
Dernière édition par Léa_ le 24 Nov 2012, 22:23, édité 3 fois.
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Re: Immunoprécipitation

Messagepar Raphaëlle » 22 Nov 2012, 17:56

Pour pas faire de doublon je vais poster à la suite parce que moi aussi ca me pose problème :mrgreen:

J'aimerais savoir si je fais fausse route ou pas... Je pense que pour cette expérience on cherche à savoir si dans telle ou telle partie du génome notre modification post traductionnelle d'une histone est très fréquente ou pas
Donc à mon avis le Rip permettrait de savoir si bcp d'histones ont la modification dans la région d'ADN qu'on a sélectionné

Et Rc c'est savoir si dans la totalité du génome on a cette modification en grande quantité ou pas

Et Rip/Rc c'est pour savoir si par rapport à la totalité du génome si la région qu'on a étudié en contient bcp ou pas (donc si c'est inférieur à 1 ça correspond à une région qui comporte peu d'histone qui ont la modification post traductionnelle que l'on recherche par rapport au génome en entier)

Après les étapes j'ai un peu les mêmes questions que toi, je suis un peu bloquée avec le terme "enrichi" je comprends pas trop à quoi ça correspond, c'est peut être la modification post traductionnelle qui rajoute qq chose à l'ADN donc du coup on dit qu'il est enrichit?


PS : J'ai lu le post d'Ondine mais je suis pas totalement convaincue d'avoir compris parce que ce que j'ai écris plus haut est tiré de la ronéo de cette année mais j'ai l'impression que ça correspond pas du tout au post d'Ondine :dont-know:
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Re: Immunoprécipitation

Messagepar Léa_ » 22 Nov 2012, 23:21

De même pour le post d'Ondine :?

D'abord merci d'avoir répondu :)

Ensuite ce qui me gène pour le Rc en fait, c'est que la seule quantité d'ADN qui possède la modification recherchée qu'on connait c'est celle qu'on a dans l'immunoprécipitat..
Je le vois comme ça : en gros on cherche le nombre de filles qui ont un tee shirt rose dans un amphi. On les sélectionne, on les compte, on fait le rapport par rapport aux nombre de filles totale de l'amphi :arrow: Rip
Puis pour le Rc, d'après ce que je comprend, c'est comme si on comparait ce nombre de fille (qui ont un tee shirt rose) au nombre total de filles à Nice !
Ce qui n'a pas de sens, puisqu'on ne sait pas si dans d'autres amphis d'autres filles ont des tee shirt roses (donc par rapport à l'ADN, on ne sait pas si la modification se trouve ailleurs dans le génome puisqu'on a étudié que sur une région ! )

Donc j'ai vraiment du mal à saisir comment on fait ces rapports Rip et Rc, et même à quoi ils correspondent exactement.

:hypnotized:
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Re: Immunoprécipitation

Messagepar -Alexis » 24 Nov 2012, 12:02

Salut à tous ! J'ai voulu faire mon come-back et vous pondre un truc bien, mais après plus de 4h passées dessus, je bloque... Je ne trouve pas le moyen de vous sortir l'explication qui illuminerait votre cerveau... Du coup je vous mets déjà le début avec dedans, la réponse pour "l'enrichissement". Pour la suite, je vois avec les tuteurs actuels et avec Ondine (tutrice de l'an dernier avec moi qui avait fait cette partie).
En attendant, ce qu'il faut retenir de Rip et Rc sans chercher à comprendre la méthode (je répète, si j'arrive à vous trouver une explication claire, je vous la mettrai) :

Rip : Quantité du fragment PCR qui nous intéresse DANS LʼIMMUNOPRECIPITAT / quantité totale dʼADN
Rc : Quantité fragment PCR qui nous intéresse dans lʼInput / quantité totale dʼADN
Si Rip/Rc>1 c'est que notre immunoprécipita a bien été enrichi.

Pour le reste :

IMMUNOPRECIPITATION


1ère étape :

On fixe la cellule, on fait des pontage avec des agents bivalents. En gros ça veut dire qu'on stabilise, qu'on scelle, qu'on immortalise les liaisons protéine-protéine et les liaisons protéine-ADN. Donc en gros, ça fige les interactions entre les nucléosomes, l'ADN et les protéines autour.


2ème étape :

On fragmente la chromatine qui va être découpée en plusieurs morceaux. Attention, la chromatine est toujours attachées aux nucléosomes puisqu'on a fait les pontages durant la première étape.


3ème étape :

On purifie la chromatine. C''est à dire qu'on dégrade toute la cellule et tout ce qu'il y a dedans SAUF la chromatine qu'on va garder pour étudier.
Rappel : cette chromatine est composée de plusieurs petits fragments (voir étape 2 !)

4ème étape :

On va à la pêche au nucléosome ! On prend un anticorps spécifique d'une modification d'histone. Par exemple un anticorps capable de reconnaître un H3K4 actylé sur un nucléosome.
Du coup, si sur un fragment d'ADN comportant 4 nucléosomes (comme sur la diapo du prof), au moins un de ceux-ci possède la lysine 4 (K4) de son histone H3 acétylé, on va "pêcher" tout le fragment (même si les 3 autres nucléosomes n'ont pas cette modification).

C'est ça l'immunoprécipitation : on a mis des Ac dans notre bouillie de fragments d'ADN, les fragments d'ADN qui possédaient la modification recherchée ont formé des complexes immuns avec nos Ac et ont précipité ! On a récupéré le précipita et on a jeté le reste de l'ADN. On dit que notre précipita c'est de l'ADN enrichi en nucléosomes comportant une acétylation de la lysine 4 (K4) de l'histone H3. Cet ADN est enrichi en H3K4 acétylé parce que dans cet ADN-là, il y a proportionnellement plus de H3K4 acétylé que dans un ADN complet. Je répète, on a enlevé tous les fragments sur lesquels il n'y avai AUCUN nucléosome comportant cette modification. Donc même si c'est pas parfait, on a fait un peu le ménage quand même.

Ici, la méthode pour enrichir c'était l'immunoprécipitation.

Autre exemple d'enrichissement... L'URANIUM !! Vous avez tous entendu l'an dernier, y'a 2 ans et y'a 3 ans dans les actualité à propos de l'Iran ! En fait, pour pouvoir exploiter l'uranium pour en faire une bombe ou pour en faire un putain de combustible pour des centrales nucléaires, il faut l'enrichir. Qu'est ce que ça veut dire ? Quand on chope de l'uranium dans les mines, y'en a que 0,71% qui est bien pour être utilisé dans une centrale nucléaire et faire une fission. C'est l'uranium 235. Or, pour faire une fission dans un réacteur, on a besoin d'avoir une proportion de 3% à 5% de cette uranium 235 parmi notre quantité totale d'Uranium. Du coup, il va falloir utiliser tout un tas de procédé pour que ce pourcentage (0,71%) d'uranium utilisable augmente dans notre quantité totale d'uranium et arrive au moins à 3% ! Donc on fait des manip et petit à petit (c'est ultra compliqué) on arrive à dégager de l'uranium inutile pour augmenter la proportion d'uranium 235 !
C'est ça les usines d'enrichissement de l'uranium ! C'est ça l'uranium enrichit !

Et c'est la même chose avec notre H3K4 acétylé ! Y'en a une certaine proportion dans notre ADN. On jette une partie de l'ADN qui n'a pas de H3K4 acétylé et on a enrichi notre ADN en H3K4 acétylé !

(Je pense que ça fait au moins une question à laquelle j'ai répondu là ! ^^)


5ème étape :

On reverse le pontage. On chauffe, ce qui permet de supprimer les liaisons entre les protéines et l'ADN !


...

Vraiment désolé de ne pas trouver d'explication pour l'instant...
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Re: Immunoprécipitation

Messagepar Léa_ » 24 Nov 2012, 12:43

MERCI déjà Alexis pour cette réponse, pour l'enrichissement c'est parfait, plus une once de doute dans mon esprit :mrgreen: (et on voit que t'y as mis du coeur :lol: )

Apres pour les rapports, bien évidemment je vais apprendre ça tel quel mais c'est vrai que si on pousse un peu ça parait très bizarre la manière dont on les obtient, donc bon si tu ne trouves pas de réponse c'est pas grave, Gilson devrait s'en tenir à son cours non ?

Encore Merci !

:bye:
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Re: Immunoprécipitation

Messagepar -Alexis » 24 Nov 2012, 14:10

Oui, Gilson devrait s'en tenir à son cours. D'autant plus que je connais les annales de Gilson (Lyon + Nice) à peu près par coeur et qu'il me semble ne jamais avoir vu de qcm sur l'immunoprécipitation tant en cours qu'en expérience...
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Re: Immunoprécipitation

Messagepar Léa_ » 24 Nov 2012, 14:16

Dans ce cas ça devrait aller, si tes co tuteurs en savent un peu plus ça m'intéresse mais sinon vous arrachez pas les cheveux dessus. Je passe le sujet en OK ;)
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Re: [OK]Immunoprécipitation

Messagepar -Alexis » 24 Nov 2012, 15:13

Apparemment non, ce sont eux qui m'ont appelé à la rescousse pour ce post ^^
J'essaye d'en savoir plus et de faire d'autres recherches dans le week end ;)
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Re: Immunoprécipitation

Messagepar Fat'Matt » 24 Nov 2012, 21:49

Léa_ a écrit:De même pour le post d'Ondine :?

D'abord merci d'avoir répondu :)

Ensuite ce qui me gène pour le Rc en fait, c'est que la seule quantité d'ADN qui possède la modification recherchée qu'on connait c'est celle qu'on a dans l'immunoprécipitat..
Je le vois comme ça : en gros on cherche le nombre de filles qui ont un tee shirt rose dans un amphi. On les sélectionne, on les compte, on fait le rapport par rapport aux nombre de filles totale de l'amphi :arrow: Rip
Puis pour le Rc, d'après ce que je comprend, c'est comme si on comparait ce nombre de fille (qui ont un tee shirt rose) au nombre total de filles à Nice !
Ce qui n'a pas de sens, puisqu'on ne sait pas si dans d'autres amphis d'autres filles ont des tee shirt roses (donc par rapport à l'ADN, on ne sait pas si la modification se trouve ailleurs dans le génome puisqu'on a étudié que sur une région ! )

Donc j'ai vraiment du mal à saisir comment on fait ces rapports Rip et Rc, et même à quoi ils correspondent exactement.

:hypnotized:



Alors bien que ce soit super dur à comprendre, et en reprenant l'exemple des tee shirt roses ^^, voilà ce que j'ai compris:

On veut étudier le nombre de tee shirt roses portées par les filles de Nice, qui sont réparties en fait en différents groupes de filles. Donc on fait l'expérience, et on obtient:

-Différents groupes où il y a au moins un tee shirt rose portée par une fille, ( on a viré les groupes où il y avait aucune fille qui n'ont pas de tee shirt rose (Et si tu suis le raisonnement, dans ces groupes tu as au minimum un tee shirt rose, mais aussi d'autres couleurs.. ) ) c'est donc ce qui va constitué un groupe plus global qui est celui enrichi en quelque sorte. . Donc on a ''séléctionné'' ce groupe et on regarde au sein de ce groupe, le total de tee shirt rose par rapport au nombre total de tee shirt des filles du groupe --> On a le rip. Donc plus on a de tee shirt roses dans le groupe, plus le rapport est élevé, plus s'est enrichi :)

-Puis, on reprend notre population totale de filles de Nice, et là on regarde combien y'a t'il de tee shirt roses en fonction de cette population totale (et non plus en fonction du groupe séléctionné ). ---> Rc

Et donc pour F=Rip/Rc --> Si on a un Rip plus important, c'est qu'on a par exemple 10 tee shirt rose / 20 tee shirt (dans groupe enrichi ), et Rc: 100/500 tee shirt (dans population totale ) . F>1, on a donc Rip>Rc --> Enrichissement.

Si Rip<Rc, c'est qu'on a genre Rip: 3 tee shirt rose/20 tee shirt, et un Rc: 100/500. On a donc une région dépourvue en tee shirt roses par rapport au reste de la population.

Si Rip=Rc, on a Rip: 4 tee shirt roses, sur 20 tee shirts, et un Rc: 100/500, F=1, dans ce cas bonne corrélation, t'es dans la ''moyenne'' en quelque sorte, donc ni plus ni moins de tee shirt rose que le reste de la population.

En reprenant la démarche avec Population=Génome=Input, tee shirt rose= Lysine 9 Méthylée sur H3, et différents groupes de filles avec tee shirt roses= fragments d'ADN portant la modification, mais ayant des nucléosomes sans la modification recherchée également, c'est assez cohérent selon moi, en espérant que ce soit pas un désastre parce que c'est bien galère à essayer d'imager ^^
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Re: [OK]Immunoprécipitation

Messagepar Léa_ » 24 Nov 2012, 22:22

C'est assez drôle de réfléchir avec des filles au tee shirt roses, et qui emmènent leurs copines :mrgreen:
Blague à part, j'ai très bien compris ce que tu m'as expliqué, donc pour ça merci :)

La seule chose qui me gène (encore !) c'est la façon dont on va connaître 'le nombre total de filles au tee shirt rose' dans la population à Nice.

La je parle uniquement en terme de manipulation, j'ai compris le principe, mais comment peut on connaitre exactement le nombre de nucléosomes/fragments d'adn portant la modification dans tout le génome ?
Bien que, encore une fois, c'est du détail et la seule partie théorique est importante.
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Re: [En discussion]Immunoprécipitation

Messagepar -Alexis » 24 Nov 2012, 22:24

Oui, tu as bien compris c'est ça. Mais ça ne répond pas aux questions de "comment ça se passe dans l'expérience". Dans tous les cas c'est ce qu'il faut retenir à ça suffira largement pour le concours !
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Re: [En discussion]Immunoprécipitation

Messagepar Ludi » 24 Nov 2012, 23:43

Coucou,

j'ai compris la longue explication d'alexis ^^mais j'ai un hic si j'enrichit mon ADN..c'est logique que j'en aurait toujours + à la fin que dans l'input..du coup j'aurai toujours Rip >> Rc ... j'aimerai qu'on arrive à me trouver qqch qui me contredit et je pense que ca aidera un paquet de monde :mrgreen:

merci beaucoup :)

:kiss: :kiss:
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Re: [En discussion]Immunoprécipitation

Messagepar Bittoucell » 25 Nov 2012, 08:39

A vrai dire, quand tu enrichis tu augmente le pourcentage de chromatine avec la modification mais pas la quantité donc le ratio ne se verra pas modifié par l'enrichissement. Tu vois ce que je veux dire ?
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Re: [En discussion]Immunoprécipitation

Messagepar Ludi » 25 Nov 2012, 10:53

ah oki oui j'ai compris ;) en gros c'est comme si j'avais des gateaux et j'augmentais leur épaisseur mais pas la quantité c'est ca ?
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Re: [En discussion]Immunoprécipitation

Messagepar Bittoucell » 25 Nov 2012, 11:11

ça serait plus comme si tu comparais deux populations. Tu veux voir combien y'a de blonds. Dans celle où tu enrichis en blond, en fait, t'essayes d'enlever tous les bruns, roux et châtains :arrow: t'as toujours le même nombre de blonds mais t'as plutôt 97% que 30% (avant l'enrichissement)
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Re: [En discussion]Immunoprécipitation

Messagepar Ludi » 25 Nov 2012, 11:16

ah ca y'est j'ai compris good :-) !!!! car en fait je croyais que l'enrichissement se faisait après l'immunoprécipitation ... au final c'est au même moment quoi..c'est quand dans l'expérience de gigi on met d'un côté tous ceux de la même couleur avec les anticorps ?

je me suis pris la tête pour rien au final ^^ merci
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Re: [En discussion]Immunoprécipitation

Messagepar Ludi » 25 Nov 2012, 11:18

mais au final mon rapport Rip sera toujours plus grand que le Rc...:/
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Re: [En discussion]Immunoprécipitation

Messagepar Raphaëlle » 25 Nov 2012, 11:21

Ah j'ai compris l'enrichissement grâce à ton exemple sur les blonds!!!! MERCIIIIIII :D

Juste une dernière question pour les rapports, est-ce que la quantité totale d'ADN (le dénominateur) est le même dans les deux cas
Ou dans le Rip on prend la quantité totale = la portion d'ADN qu'on a choisit au départ
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Re: [En discussion]Immunoprécipitation

Messagepar Bittoucell » 25 Nov 2012, 11:30

Je crois que dans les deux cas, "quantité totale d'ADN" représente la même chose. Sinon, les deux rapports ne seraient pas comparables.

@ Ludi : Pas nécessairement : si jamais on a 4 blonds des deux côté, t'auras le même rapport.
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Re: [En discussion]Immunoprécipitation

Messagepar Ludi » 25 Nov 2012, 12:30

Moi perso dans Rip le total c'est le total après immunoprécipitation mais pas enrichissement donc on peut avoir des ADN avec un nucléosome avec un Ac mais pas de la couleur de l'Ac correspondant et dans Rc le total total ><

et ok bitoucell mais on peut pas avoir Rip < Rc ?
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