Salut à tous ! J'ai voulu faire mon come-back et vous pondre un truc bien, mais après plus de 4h passées dessus, je bloque... Je ne trouve pas le moyen de vous sortir l'explication qui illuminerait votre cerveau... Du coup je vous mets déjà le début avec dedans, la réponse pour "l'enrichissement". Pour la suite, je vois avec les tuteurs actuels et avec Ondine (tutrice de l'an dernier avec moi qui avait fait cette partie).
En attendant, ce qu'il faut retenir de Rip et Rc sans chercher à comprendre la méthode (je répète, si j'arrive à vous trouver une explication claire, je vous la mettrai) :
Rip : Quantité du fragment PCR qui nous intéresse DANS LʼIMMUNOPRECIPITAT / quantité totale dʼADN
Rc : Quantité fragment PCR qui nous intéresse dans lʼInput / quantité totale dʼADN
Si Rip/Rc>1 c'est que notre immunoprécipita a bien été enrichi.
Pour le reste :
IMMUNOPRECIPITATION
1ère étape :On
fixe la cellule, on fait des pontage avec des agents bivalents. En gros ça veut dire qu'on stabilise, qu'on scelle, qu'on immortalise les
liaisons protéine-protéine et les
liaisons protéine-ADN. Donc en gros, ça fige les interactions entre les nucléosomes, l'ADN et les protéines autour.
2ème étape :On
fragmente la chromatine qui va être découpée en plusieurs morceaux. Attention, la chromatine est toujours attachées aux nucléosomes puisqu'on a fait les pontages durant la première étape.
3ème étape :On
purifie la chromatine. C''est à dire qu'on dégrade toute la cellule et tout ce qu'il y a dedans
SAUF la chromatine qu'on va garder pour étudier.
Rappel : cette chromatine est composée de plusieurs petits fragments (voir étape 2 !)
4ème étape :On va à la
pêche au nucléosome ! On prend un anticorps spécifique d'une modification d'histone. Par exemple un anticorps capable de reconnaître un H3K4 actylé sur un nucléosome.
Du coup, si sur un fragment d'ADN comportant 4 nucléosomes (comme sur la diapo du prof), au moins un de ceux-ci possède la lysine 4 (K4) de son histone H3 acétylé, on va "pêcher" tout le fragment (même si les 3 autres nucléosomes n'ont pas cette modification).
C'est ça l'immunoprécipitation : on a mis des Ac dans notre bouillie de fragments d'ADN, les fragments d'ADN qui possédaient la modification recherchée ont formé des complexes immuns avec nos Ac et ont précipité ! On a récupéré le précipita et on a jeté le reste de l'ADN. On dit que notre précipita c'est de l'ADN enrichi en nucléosomes comportant une acétylation de la lysine 4 (K4) de l'histone H3. Cet ADN est enrichi en H3K4 acétylé parce que dans cet ADN-là, il y a proportionnellement plus de H3K4 acétylé que dans un ADN complet. Je répète, on a enlevé tous les fragments sur lesquels il n'y avai AUCUN nucléosome comportant cette modification. Donc même si c'est pas parfait, on a fait un peu le ménage quand même.
Ici, la méthode pour enrichir c'était l'immunoprécipitation.
Autre exemple d'enrichissement... L'URANIUM !! Vous avez tous entendu l'an dernier, y'a 2 ans et y'a 3 ans dans les actualité à propos de l'Iran ! En fait, pour pouvoir exploiter l'uranium pour en faire une bombe ou pour en faire un putain de combustible pour des centrales nucléaires, il faut l'enrichir. Qu'est ce que ça veut dire ? Quand on chope de l'uranium dans les mines, y'en a que 0,71% qui est bien pour être utilisé dans une centrale nucléaire et faire une fission. C'est l'uranium 235. Or, pour faire une fission dans un réacteur, on a besoin d'avoir une proportion de 3% à 5% de cette uranium 235 parmi notre quantité totale d'Uranium. Du coup, il va falloir utiliser tout un tas de procédé pour que ce pourcentage (0,71%) d'uranium utilisable augmente dans notre quantité totale d'uranium et arrive au moins à 3% ! Donc on fait des manip et petit à petit (c'est ultra compliqué) on arrive à dégager de l'uranium inutile pour augmenter la proportion d'uranium 235 !
C'est ça les usines d'enrichissement de l'uranium ! C'est ça l'uranium enrichit !
Et c'est la même chose avec notre H3K4 acétylé ! Y'en a une certaine proportion dans notre ADN. On jette une partie de l'ADN qui n'a pas de H3K4 acétylé et on a enrichi notre ADN en H3K4 acétylé !
(Je pense que ça fait au moins une question à laquelle j'ai répondu là ! ^^)
5ème étape :On
reverse le pontage. On chauffe, ce qui permet de supprimer les liaisons entre les protéines et l'ADN !
...
Vraiment désolé de ne pas trouver d'explication pour l'instant...