Moi aussi ça m’intéresse, c'est le bazar dans ma tête... !
Et j'ai qq petites questions sur ce même sujet. Comme c'est compliqué, je reprends mon raisonnement.
Si je reprends tout du début :
On a un malade qui a hérité du gène muté du père et d'un gène muté de la mère.
Mais les
deux parents n'ont pas la même mutation.On fait une PCR et
séquençage des exons, on découvre la
mutation du père : un
nT remplacé par un autre.
On est content
mais pas complètement parce qu'on a l'impression, au vu des exons, que la mère est normale.
Or, pour que l'enfant soit malade, c'est que la
mère cache une mutation. Si on ne la voit pas au séquençage des exons, on se dit que c'est peut-être une mutation fourbe qui est
dans les introns, région normalement qui n'est pas codante.
On prend des primers aux extrémités des régions exoniques on encadre nos régions introniques, on
séquence nos introns, on trouve qu'il y a un
site cryptique d'épissage chez la mère. On veut faire une PCR des introns, mais il faut passer par de l'
ARN. On a un ADN double brin, c'est l'ADN de l'enfant malade
il fait sa transcription
on a notre ARN
maturation
ARNm (moitié muté et moitié normal car enfant hétérozygote des mutations)
reverse transcriptase
on a notre ADNc (qui présente deux bandes à l'électrophorèse
moitié normal = ARNm normal du père (du point de vue de l'épissage) et
moitié chelou parce qu'il a une région intronique en plus = ARNm de la mère anormal)
Quand on séquence, on voit que ça se superpose à partir du moment où il y a le site cryptique d'épissage que l'on souhaite identifier.
Bon. On se dit qu'on va la trouver cette mutation de la mère ! On va devoir mettre l'allèle normal du père (du point de vue épissage) d'un côté et celui de la mère de l'autre.
On va utiliser le
clonage moléculaire. Et là, j'ai une grande question :
Est-ce que l'ADN recombinant est un ADN double brin (avec la version de la mère ET du père) ou simple brin (ADN de la mère OU du père) ?Parce que je crois que je capte pas la suite sinon...
Si c'est
l'ADN de la mère OU du père, je ne comprends pas pourquoi est-ce qu'on fait tout ce clonage vu que d'emblée on a les deux allèles séparés..
Si c'est de l'
ADN mélangé, je ne comprends pas comment les deux populations vont pouvoir un jour se séparer...
Sinon, pour le clonage, de ce que j'ai compris, c'est que l'on met notre
ADN dans un vecteur. Le vecteur est intégré dans une
bactérie.
La bactérie
se multiplie. On a donc pleeeins de copie de notre ADN recombinant dans la bactérie.
Mais je comprends pas quel est l'ADN dans nos bactéries.. père ou mère ? Les deux ? (je passe sur les méthodes pour s'assurer que le vecteur a bien été intégré, ça, je crois que j'ai bien compris!)
Et je ne comprends pas non plus
pourquoi quand on place les bactéries sur une boîte de pétri, on sait qu'elles ne se sont pas mélangées, que telle colonie est différente d'une autre?
On les place cellule après cellule avec une genre de micro pipette ? Mais ça doit être ultra fastidieux !
Donc :
Pourquoi les bactéries ne sont pas mélangées dans la boîte de pétri ? Après, on
récupère une colonie (vu qu'une bactérie
se reproduit à l'identique, on sait que si on a mis telle bactérie dans tel puit, la colonie qui en est issue est strictement identique à la cellule de départ)
Donc on récupère chacune de nos colonies, on centrifuge, on extrait notre ADN recombinant et HOP ! On fait un séquençage des différentes colonies et on en déduit la séquence du père (normale) et celle de la mère (donc on a trouvé notre mutation!) (c'est la ce qui se passe à la fin?)
Donc les points flous où je suis perdue c'est ceux là :
Quelle est la nature du produit PCR que l'on injecte dans le vecteur ? (ADN mixte père-mère ou déjà séparés ? (à ce moment là le clonage n'a plus d'interet)
Si c'est un ADN mélangé père-mère, comment ces deux populations vont-elles se séparer dans la bactérie vu qu'une bactérie à la propriété de se cloner et donc de se reproduire à l'identique à l'infini ? Les deux populations ne seront donc jamais séparées...? (j'ai pas compris..)
Comment sont séparées les colonies sur la boîte de pétri ? A quoi sert le séquençage de fin ?Et dernière petite question :
Peut-on partir de l'ADN hétérozygote de la mère ? C'est à peu près pareil, sauf qu'on aura à séparer l'allèle sauvage du muté (et non celui du père et celui de la mère). Mais niveau conclusion, on aboutira à la même chose non ? On connaitra l'origine et la nature de la mutation intronique de la mère..?
Mille fois
désolée pour ce post de la mort, mais j'avais besoin de
poser étaler mon raisonnement.. Au moins, si j'ai dit une énormité (et c'est très possible), tout le monde la verra bien et je verrai où ma 'logique' foire
Merci d'avance, pardon-désolée et bonne journée !
Et pardon pour ce post ... J'ai essayé d'être au plus clair (je sais pas si ça a marché)
![[Résolu]](././styles/prosilver/imageset/icon_topic_solved.gif "[Résolu]"){kind=icon}
qu'il repose en paix 
.
Tout le début est parfait 
Du coup, dès le choix du vecteur, on va en prendre un qui possède au sein même du polylinker ou site de multiclonage, le gène de la B-galactosidase. Je reviens pas sur pourquoi bleue ou blanc, et pourquoi on sélectionne les blancs à moins que vous ayez besoin 
