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Sphère/bille/puce/puit

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Sphère/bille/puce/puit

Messagepar LAMsa » 05 Avr 2015, 17:32

Couwcou !

S'il vous plait, j'aimerais qu'on m'éclaire sur un point joli concernant le fonctionnement du système commercialisé par Life Technologie :clap:

:arrow: Pourrait-on m'expliquer s'il vous plait la différence et la fonction des billes, des sphères, des puits et des puces ? :hypnotized: Je ne vois pas trop ce qu'on veut dire par cette phrase en faite :lol: : "Les sphères sont séparées par de petites puces et chaque bille se met sur un trou (il y a 1 à 11 millions de puits par puces)." #Epilepsy

Merci d'avance et poutoux nouveaux :D !
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Re: Sphère/bille/puce/puit

Messagepar LAMsa » 23 Avr 2015, 15:14

:jump:
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Re: Sphère/bille/puce/puit

Messagepar LAMsa » 07 Mai 2015, 15:48

:jump:
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Re: Sphère/bille/puce/puit

Messagepar popsi » 08 Mai 2015, 15:23

Moi je comprends pas trop la difference entre la technique de life technologie et de la roche ? @@
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Re: Sphère/bille/puce/puit

Messagepar popsi » 12 Mai 2015, 21:11

:)
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Re: Sphère/bille/puce/puit

Messagepar popsi » 15 Mai 2015, 17:28

:devil:
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Re: Sphère/bille/puce/puit

Messagepar Azula » 18 Mai 2015, 08:39

Salut :)

J'avais répondu à ce post en faisant un long récap' mais il n'a pas été envoyé :weep: :weep:

Déjà regarde les diapos de la tut rentrée à la fin il y a un bonus sur la PCR à haut débit avec vidéo et tout, ça peut t'aider à mieux visualiser :soldier: dans le centre de téléchargement :
:arrow: viewtopic.php?f=605&t=63716

Mais visionne ça d'abord : https://www.youtube.com/watch?v=WYBzbxIfuKs
Puis lis ça :
Fonctionnement :
1) Fragmentation de l’ADN
2) Fixation adaptateurs en 5’ et 3’
3) Chaque fragment d’ADN sera piégé sur une sphère
4) Émulsion huile-réactifs de façon à créer des micro-réacteurs = chaque goutte contenant une sphère et tout les réactifs nécessaires à l’amplification PCR (Taq polymérase, les primers …)
5)Amplification de chaque fragment d’ADN (PCR en émulsion)
6) On place ces sphères dans des puits recouvrant une puce de 2-3cm de diamètre (1 puce = 1 à 11 millions de puits = 1 à 11 millions de réactions simultanées)
7) Séquentiellement l’appareil va envoyer les différents nucléotides A,T,G,C
8) Si le nucléotide envoyé a été incorporé par la polymérase, le séquenceur mesurera une variation de pH dû à la libération d’un proton lors de la formation de la liaison phosphodiester


Et si ça te pose encore problème, je te refais un récap pas de soucis :)

Bon courage <3 et désolée pour l'attente :sidefrown:
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Re: Sphère/bille/puce/puit

Messagepar popsi » 18 Mai 2015, 13:25

Merci pour ta réponse :D mais ducoup c'est quoi la différence entre la méthode de la roche et life technologies ? :beat-up:
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Re: Sphère/bille/puce/puit

Messagepar Azula » 18 Mai 2015, 14:12

Coucou :)

La différence c'est le support soit solide, soit bille d'agarose.
Et c'est aussi la méthode de discriminations des nucléotides intégrés.
Tu as vu dans la vidéo sur lifes technologies qu'on envoyait successivement de l'Adénine si il y a une variation de pH ça veut dire qu'il a été intégré. Pourquoi ? Parce que la formation de la liaison phosphodiester libère un proton ( H+) = le pH diminue. Et on répète successivement, cette opération avec tout les autres nucléotides.

Mais c'est spécifique de la technologie life technologies.

Pour les autres technologies (Illumia, Roche), on sait si le nucléotide envoyé à bien été intégré si il y a une variation de fluorescenceet non pas de pH.
Je te laisse le tableau que j'avais fait dans le diapo de la tut rentrée vraiment je te conseilles de le lire et de visionner les vidéos que j'y ai jointes
diff.PNG
Image1.png


Ca va mieux ?
Là je suis en cours, mais si ça va pas je prendrais le temps de mieux t'expliquer ce soir :soldier:
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Re: Sphère/bille/puce/puit

Messagepar popsi » 18 Mai 2015, 15:59

C'est parfait merci beaucoup ! Juste pour être sur d'avoir bien compris: pour la roche -> le séquençage se fait en temps réel (avec les variations de pH), alors que pour les 2 autres techniques c'est un séquençage classique avec tube capillaire ?
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Re: Sphère/bille/puce/puit

Messagepar popsi » 20 Mai 2015, 08:09

up :weep:
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Re: Sphère/bille/puce/puit

Messagepar Gollum » 20 Mai 2015, 13:33

Salut :)

Alors:

-déjà où as-tu entendu parlé de séquençage "temps réel"?. Ces 3 techniques sont des techniques de séquençage haut débit !

- C'est la technique life technologie qui utilise la variation de pH pour son séquençage (c'est dans le tableau du message d'Azula juste au dessus :wink2: )

- Pour roche et illumina ce ne sont pas des "tube capillaire" (où as-tu vu ca?) mais respectivement des billes d'agarose et un support solide qui sont utilisés. et surtout on fait le séquençage grâce à la variation de fluorescence et non de pH.


Le tableau du message d'Azula juste au dessus est vraiment a retenir ! si tu n'as rien compris là dessus retiens seulement ca ! ;)

J'espère que ca répond a ta question
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Re: Sphère/bille/puce/puit

Messagepar popsi » 20 Mai 2015, 17:02

ben en fait je me suis dit que pour lire la fluo il fallait un tube capillaire (comme pour la PCR-séquençage) ?! :O
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Re: Sphère/bille/puce/puit

Messagepar Azula » 20 Mai 2015, 19:12

Non ça n'a rien presque à voir, si ce n'est que 1 nucléotide donné = 1 couleur donné, Mais dans le séquenceur à haut débit roche et illumina le nucléotide est fluorescent mais ne stoppe pas l'élongation, ça reste un dNTP et non pas un ddNTP. Ce n'est pas la meme logique

Dans le tube capillaire t'as un détecteur laser et le dernier nucléotide (ddNTPs) de chaque fragment (du plus court au plus long car ils ont été séparé dans le tube capillaire) sont lus 1 à 1 en fonction de la couleur détectée. On détermine alors la séquence d'une région d'ADN. Ce nucléotide fluo est mis dans la machine en moindre quantité comparé aux nucléotides normaux qui ne bloquent pas l'élongation ET sont intégré au hasard. Ca permet au bout de plusieurs cycle, d'avoir un ddNTP à différentes positions = avoir toutes les tailles de fragments = pourvoir déterminer tout les nucloétides du gène d'intérêt qu'on a séquencé.
capillaire.PNG


Pour les séquenceurs à haut débit roche et illumina, voici comment ça fonctionne :
:arrow: https://www.youtube.com/watch?v=rsJoG-AulNE
:arrow: https://www.youtube.com/watch?v=womKfikWlxM
Ce n'est pas très détaillé dans le cours, comme t'as dit Gollum si tu retiens le tableau ce sera très largement suffisant :glasses-nerdy:

En fait, dans le séquenceur à haut débit, on balance succesivement A, T, G, et C fluo et s'ils sont intégrés on lit alors la couleur correspondante dans le puit. Chaque puce contient des milliers de puits, l'ADN a été fragmenté en petits morceaux et chaque puit contient un morceau distinct. Tout ces milliers de fragments différents seront amplifiés EN PARALLELE. On peut alors séquencer tout le génome = quantité d'info astronomique différent des 150 pb à 3000 pb permis par la méthode Sanger. C'est une technique ++ complexe. Tout les nucléotides balancés sont fluo et si ils sont intégrés on peut dire lequel en fonction de la couleur lue.
Ex :
le puits numéro 3 va clignoter vert/bleu/rouge/jaune/vert/vert/bleue = ATGCAAT
le puits numéro 1223 en même temps va clignoter bleu/bleu/bleu/ rouge/vert/jaune/jaune = TTTGACC


Je te remets la définition du séquençage à haut débit :
« Séquençage massif en parallèle de molécules d’ADN individuellement séparées et amplifiées sous forme de clones ou de molécules unique. »

Voilà j'espère que tu vois mieux la différence, certes les utilisent la fluorescence pour discriminer le nucléotide intégré, mais cela dans des logique totalement différentes Le premier après migration pour séparé les fragments en fonction de la taille et avec utilisation de ddNTPs Le second avec utilisation que de dNTPs, en parallèle, avec lecture en direct (couleur qui clignote), dans une puce qui contient des milliers de puits. Fin t'as plein de différences.

On est de tout coeur avec vous, bon courage pour demain <3 <3 :fingers-crossed:
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Re: Sphère/bille/puce/puit

Messagepar popsi » 20 Mai 2015, 20:38

c'est bon j'ai ENFIN compris !!! merci beaucoup ! vos explication sont toujours très détaillées, vous faites vraiment un travaille super ! <3<3
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Re: Sphère/bille/puce/puit

Messagepar Azula » 20 Mai 2015, 21:47

Aaaah tant mieux alors :jump: :jump: :clap:

<3
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