Coucou
Il n'est jamais trop tard hein, non sérieusement désolée je n'avais pas vu ton post
Je ne comprends pas trop ton soucis...
Ici tu suspectes une maladie dont tu connais les mutations causales : c.1672 C>T ou c.1839 G>A.
Pour les détecter il te suffit de faire soit PCR RLFP (enzyme de restriction spé coupe si t'as la mutation, du coup 2 bandes au lieu d'une ect comme dans l'achondroplasie) soit PCR séquençage (sans passer par digestion enzymatique, tu séquences directement la région autour de la position 1672 et 1839 pour lire directement si il y a eu une des 2 substitutions).
Mais si la mutation est celle du variant d'épissage et ben tu détecteras rien par ces 2 techniques citées plus haut car avec la PCR on ne séquence que les exons. Or dans ce cas on la mutation est dans les introns. Du coup, on part de l'ARN pour voir si il est plus lourd, ce qui voudrais dire qu'il y a eu insertion intronique ( l'épissage n'a pas fait son boulot exciser tout les introns à cause de la mutation créant un site cryptique d'épissage).
Pour lire cette mutation tu seras amener à faire un clonage moléculaire avec toutes les étapes que cela impliquent comme la transformation bactérienne.
Le clonage d'expression n'a pas de sens ici. C'est plus pour une maladie donc tu connais pas les mutations causales. Ou bien c'est quand tu découvres un nouveau variant et que tu veux prouver sa pathogénicité, c'est de plus en plus le cas car avec le séquençage à haut débit on trouve plein de nouveaux variants (polymorphisme ou mutation ? )
En fait je vois comprends ton problème, avec l'histoire de l'insertion, le northerm ect en faite j'ai voulu détailler la correction pour que ce soit plus logique mais du coup ça vous a embrouillé.
En faite, t'as une maladie, tu fais une PCR séquençage, tu découvres un nouveau variant, il faut prouver que c'est lui qui induit la maladie. Du coup tu fais s'exprimer ce variant dans une cellule eucaryote qui va transcrire ce gène étranger et traduire l'ARNm, dès lors formé, en protéine, c'est le clonage d'expression. Tu veux voir si cette mutation a eu une conséquence à l'échelle de l'ARN, tu fais alors un Northerm blot ( ARN + long = insertion d'intron / + court = délétion d'exon / absence = même pas transcrit peut-être mutation au niveau de la régulation de l'expression des gènes / trop transcrit = bande plus large / pas assez transcrit = bande + fine / transcrit qu'en mileu anaérobie ) bref t'as 1001 possibilités en génétique. Tu peux aussi faire un western-blot, pour voir la présence de la protéine je sais pas en fonction des conditions de cultures par exemple (aérobie/ anaérobie ou autre). Si c'est une protéine qui est censé s'exprimer en milieu aérobie et qui s'exprime qu'en condition anaérobie ça pose problème, ça peut-être la raison de la maladie.
Bref, pour répondre à tes questions
:
"Pour compter un item "clonage d'expression" vrai, il faut obligatoirement qu'on nous parle de pathogénicité dans l'énoncé ? " OUI Cf ronéo +diapo ou aussi étude de localisation (on peut faire exprimer un gène marqué par gfp par une cellule eucaryote pour observer la localisation de la protéine correspondante exemple tubuline autour du noyau poly 2 diapo 71, comprendre le rôle de la tubuline dans la division cellulaire ect à l'état physio sans entrer dans la patho)
Est ce que d'ailleurs, le clonage moléculaire précède toujours le Northern et Western Blot ?
NON, le northern et le western blot ont plein d'applications comme certain test VIH(détecter les anticorps spé = séropositif) ect, mais peuvent intervenir aussi après un clonage d'expression en complément pour les raisons citées plus haut.
Si non, un item "Northern Blot" aurait été vrai ou faux dans ce QCM ?
FAUX
Dans le Northern, tu utilises une sonde marquée spécifique du gêne que t'étudie pour voir si il est transcrit ou pas ou peu ect
Dans le cas du syndrome de wolfram, tu as reversetranscrit tout les ARN de la cellule car cette enzyme n'est pas spé, mais tu n'as amplifié par PCR que le gène d'intérêt (amorces spé), du coup après migration électrophorétique et révélation par bromure d’éthidium (non spécifique marque tout acides nucléides pas comme la sonde marquée = spécifique), tu vois qu'une bande et dans le cours on voit qu'elle migre +loin = + lourde = insertion.
Quoique ambiguë, car au final si tu utilises une sonde marqué spé du gène de la wolframine tu vois si elle a migré +/- loin. Mais c'est plus simple de balancer du bromure d'éthidium pour révéler le truc, que de créer au préalable une sonde complémentaire spé marquée ect C'est tellement - pertinent que je laisserais faux...
J'espère que ça répond à tes questions
Bon courage
