Amorces p1/A

[morganedipietro_]

Bonjour,

Pour le sequençage haut debit, j ai un peu du mal a comprendre et à m'y retrouver avec les étapes d'amplification de l'adn et notamment pour l'hybridation des amorces P1 et A aux extrémités 3' ou 5'.
pouvez vous m'éclairer svp ?

Merci d'avance

[Nom_de_Zeus!]

Hey !

Alors avant toute chose j'ai discuté avec la prof ce matin et elle m'a dit que ce genre de question est beaucoup trop précis par rapport à ce qu'il faut savoir pour le concours ! Même si le cours est extrêmement détaillé en ce qui concerne les étapes de la méthode, le plus important c'est que vous compreniez la logique du NGS, c'est-à-dire dans quels cas on va devoir utiliser cette technique (c'est ce genre de QCM qui est le plus discriminant d'après les stats, c'est donc sur ça que vous devez axer votre apprentissage du cours, la compréhension du contexte clinique)

Pour ce qui est de ta question, déjà ne te prends pas la tête avec ce genre de détail.
Ensuite fais très attention aux termes que tu emploies : si tu parles de P1 et A en tant qu'amorces ce n'est pas la même chose que si tu parles de P1 et A en tant qu'adaptateurs !

Lors de la préparation des échantillons on parle d'adaptateurs, l'adaptateur P1 se trouve comme indiqué sur les schémas à l'extrémité 3' du brin et l'adaptateur A adjoint du barre-code se trouve à l'extrémité 5' de ce même brin.

Maintenant d'après ta question, lors de l'amplification de l'ADN (on parle d'amorces et non plus d'adaptateurs donc), les amorces se mettent toujours au niveau de l'extrémité 3' du brin qui sert de matrice !
C'est logique puisque n'oublie pas qu'une amorce a pour but de permettre à la polymérase de synthétiser un brin d'ADN complémentaire.
Or la synthèse se fait dans le sens 5'-3'.
Et comme les brins sont antiparallèles, l'extrémité 5' du brin fils que l'on va synthétiser correspond à l'extrémité 3' du brin actuel qui fait office de matrice ! (et oui on oublie pas les enseignements du Grand Maître de la Base Azotée du premier semestre )

Maintenant attention ces amorces ne se fixent pas sur le même brin (oui là c'est le stade où ça part en cacahuète) :

- On a un brin d'ADN qui nous intéresse, il a été préparé avec ajout d'adaptateurs et d'un barre-code, rendu simple brin par dénaturation

- Notre première amorce P1 va venir s'hybrider à l'extrémité 3' du fagment d'intérêt (elle se retrouvera donc en 5' du brin nouvellement synthétisé puisque tout est antiparallèle #onserépète)

- Cette amorce contient en plus un primer qui a LA MÊME SEQUENCE que le primer attaché à la sphère (c'est très important pour la suite on va s'en resservir)

- Une fois que la polymérase a synthétisé un brin fils complémentaire qui est plus long que le brin matrice à cause de la présence du primer à l'extrémité 5' de ce nouveau brin fils, on dénature la double hélice et on dégage le brin matrice, on le jette il ne nous sert plus à rien vu qu'il n'a pas de primer

- On va alors se servir de notre deuxième amorce, l'amorce A qui a la particularité d'être biotinylée, et on va l'hybrider toujours à l'extrémité 3' mais cette fois-ci du brin qu'on vient tout juste de synthétiser (qui est donc rallongé par la présence du primer à son extrémité 5') qui va devenir notre nouveau brin matrice ! C'est très important de comprendre que le brin qui nous a servit de matrice quand on a utilisé l'amorce P1 ne nous sert plus, le brin fils de la précédente étape devient le brin matrice de celle-ci !

- On fait comme tout à l'heure, la polymérase synthétise un tout nouveau brin fils encore différent des deux autres de 5' en 3', qui cette-fois ci aura la même séquence que le tout premier brin matrice qu'on a utilisé quand on s'est servit de l'amorce P1 (vu que c'est la séquence complémentaire de la séquence complémentaire de la matrice, on peut dire que c'est par conséquent la même séquence que la matrice, le complémentaire du complémentaire d'un truc = ce même truc c'est logique )

- On obtient donc un nouveau brin fils qui possède une amorce A biotinylée en 5', la même séquence que le brin matrice originel, et là attention c'est important une extrémité 3' avec la séquence complémentaire de l'amorce et du primer qu'on avait utilisé ! Et oui car on a utilisé l'amorce et le primer qui se sont retrouvés tels quels en 5' du brin fils synthétisé à partir de la première matrice, ce même brin qui nous a ensuite servi de matrice à son tour pour synthétiser le nouveau brin fils qu'on vient tout juste d'obtenir !

- Or le primer utilisé de base avait la même séquence que les primers situés sur la sphère. Comme on vient de synthétiser un brin complémentaire, on a également obtenu à son extrémité 3' la séquence complémentaire de ce primer d'origine, c'est-à-dire la séquence complémentaire des primers de la sphère ! Tu vois où je veux en venir ?

- Ce brin fils qu'on vient de synthétiser est le premier et le seul qui possède à son extrémité 5' l'amorce A biotinylée et à son extrémité 3' le complémentaire de l'amorce P1 et surtout le complémentaire du primer de la sphère, ce qui veut dire que c'est le seul qui pourra s'apparier par complémentarité aux primers de la sphère ! (oui on a fait tout ça pour ça )

C'est pour ça que l'hybridation sur le primer de la sphère ne peut se faire qu'avec le dernier brin nouvellement synthétisé !

J'espère que tu t'y retrouveras plus comme ça avec les étapes d'amplification c'est pas évident à visualiser au départ, et retiens surtout que l'hybridation des amorces se fait toujours à l'extrémité 3' du brin qui sert de matrice pour se retrouver en 5' du brin qu'on va synthétiser lors de l'étape d'élongation par la polymérase !
C'est bon ?

[morganedipietro_]

Super merci beaucoup pour cette réponse au top !!!