Sonde Taqman

[Fantomassa]

Bonjour

Est ce que ce serait possible de me réexpliquer brievement le principe de la sonde Taqman ? J'ai vraiment du mal à comprendre cette technique

Merci d'avance

[Nom_de_Zeus!]

Hey !

On rajoute dans la réaction en plus des deux brins d'ADN et des primers un troisième fragment simple brin qui va avoir un peu le rôle d'une sonde d'hybridation

Ce fragment va en effet être complémentaire de la région d’ADN à amplifier, où il ira s’hybrider par complémentarité #c'estlogique

Cette sonde possède à une de ses extrémités un quencher et à l'autre extrémité un fluorochrome (GFP ou autre)

La sonde est donc composée d'une séquence simple brin capable de se fixer spontanément au brin d'ADN qui m'intéresse après dénaturation, et de part et d'autre de cette petite séquence j'ai un fluorochrome et un quencher qui sont donc très proches vu que cette séquence ne fait qu'une vingtaine de nucléotides

Le quencher a pour rôle d’éteindre la fluorescence du fluorochrome de la sonde: quand le quencher est à côté du fluorochrome il ne peut pas émettre de fluorescence, du coup on ne voit rien et la machine ne détecte aucune émission
Retiens que quencher = inhibiteur

Cependant cet effet inhibiteur du quencher sur le fluorochrome ne fonctionne que si les deux sont suffisamment proches physiquement, autrement dit quand ils sont chacun physiquement liés à une extrémité de la séquence nucléotidique de la sonde TaqMan

Lors de l’étape d’élongation de la PCR, la polymérase synthétise le brin complémentaire de 5’ en 3’

Au départ elle avance sur le brin qui est simple après la dénaturation et il n'y a rien pour empêcher sa progression, mais au bout d'un moment elle est gênée car la sonde est complémentaire d'une région du brin et s'est hybridée: on a donc restitué sur une vingtaine de nucléotides (la taille de la sonde) une portion double brin !

Du coup la polymérase est bloquée et ne peut plus avancer en théorie, sauf qu'elle possède en plus une activité 5’-3’ exonucléasique qui lui permet de grignoter la sonde TaqMan quand elle rentre en contact avec celle-ci pour pouvoir continuer sa progression !

Elle va donc « libérer » le fluorochrome du
quencher en dégradant la séquence nucléotidique simple brin qui les reliait, et en séparant ainsi physiquement les deux qui vont forcément s'éloigner, le fluorochrome pourra fluorescer, le quencher étant trop loin pour avoir de l'emprise sur lui !

Là encore la mesure de la fluorescence se fait à la fin de la phase d’élongation, à la fin de chaque cycle et la quantité de fluorescence générée sera également proportionnelle à la quantité d’ADN au départ

Voilà j'espère que ça ira

[Fantomassa]

C'est parfait merci
bonne soirée !