cartes restriction

[lympho6mon B]

Salut,
Comment ce fait-il qu'on ai encore des vecteurs replier sur eux même après le passage boîte de petrie avec la Galactosidase ? Du coup je ne vois pas à quoi servent ces cartes de restrictions, à part qu'on les utilisent à la place de cette étape mais je ne crois pas que la prof dit ça ?

[AnNévrisme]

Coucou

C'est une bonne question, probablement que comme pas mal de choses en science rien n'est sûr à 100%, du coup peut être que ce sont des faux positifs.
Je peux comprendre que ce détail t'intéresse si tu veux garde ta question et remet là dans le post "vague de questions aux profs" quand on va commencer à leur envoyer !

Par contre je ne suis pas certaine d'avoir bien compris ta phrase : "Du coup je ne vois pas à quoi servent ces cartes de restrictions, à part qu'on les utilisent à la place de cette étape" est ce que tu pourrais reformuler s'il te plaît ?

[lympho6mon B]

Les cartes de restrictions ont comme but d'éliminer les vecteurs repliés sur eux même non ? Du coup comme "l'étape" avec les boites de pétries et la Galactosidase, du coup c'était pour savoir si elles remplacent cette "étape" ou la perfectionne et interviennent après ?
Je sais pas si c'est plus clair ?

[AnNévrisme]

Coucou,

Alors du coup, non les cartes de restriction n'ont pas pour but d'éliminer les vecteurs repliés sur eux même.
La carte de restriction c'est le schéma sur lequel sont représentés tous les sites de restrictions des enzymes qui t'intéressent et que tu comptes utiliser.

Dans l'exemple du cours (syndrome de Wolfram) : après avoir fait l'étape de transformation, et la multiplication des bactéries. Tu vas chercher à sélectionner les bactéries ayant intégrés l'ADN recombinant intact afin d'ensuite détruire la paroi des bactéries pour extraire l'ADN recombinant afin de pouvoir séquencer ton insert.

Avant cela comme je t'ai dit tu vas devoir sélectionner les bactéries pour essayer de t'assurer que les bactéries que tu vas dégrader pour récupérer l'ADN recombinants contiendront bien l'ADN recombinant. C'est le but des deux sélections dont la prof te parle (attention : elles ne sont pas obligatoires toutes les deux et varient en fonction du vecteur utilisé etc!! )

-> la sélection à l'ampicilline qui permet de ne garder que les bactéries ayant intégré un vecteur

-> la sélection blanc-bleu à la beta galactosidase qui te permet d'essayer de t'assurer de conserver les bactéries ayant intégré un ADN recombinant (ça exclut alors les bactéries ayant intégré un vecteur qui c'est refermer sur lui-même).

Ensuite une fois que tu as dégradé ces bactéries et récupéré l'ADN recombinant c'est là que la carte de restriction intervient. Tu vas couper l'ADN recombinant avec différentes enzymes de restriction afin d'obtenir des fragments que tu feras migrer sur gel d'électrophorèse et ça te permettra d'avoir la taille de tes fragments.
Si par ex on te parle d'une mutation qui donne un ARNm tronqué de 50paires de bases par rapport à l'allèle sauvage si sur ton gel tu as les produits la taille des fragments des inserts des différents membres d'une famille tu vas pouvoir de suite savoir si un membre de la famille à un ou plusieurs allèle muté ou pas.

De plus, si à la migration tu te rend compte que ton patient contrôle sain à lui même un insert qui paraît tronqué -> tu peux penser que tu as fais une erreur dans tes étapes qui à conduit à dégrader les inserts ! Attention tous les résultats sont alors compromis et tu ne peux pas conclure sur un diagnostic (comme l'histoire du témoin négatif en pcr si tu veux).

Est ce que c'est plus clair pour toi ?

[lympho6mon B]

Wouaah, merci pour l'explication ! Déjà le début, c'est clair, je comprend, ensuite :
La carte de restriction permet de "choisir" les endroits où les enzymes de restrictions vont couper sur le vecteur c'est ça...? Pour ensuite pouvoir compter les pb que t'as en trop ou en moins par rapport à ce que tu devrait avoir ?

[AnNévrisme]

En fait, les vecteurs sont commercialisés donc quand ils les reçoivent au laboratoire il les reçoivent avec la notice où figurent tous les sites de restrictions (pour différentes enzymes) que comporte le vecteur.

La carte de restriction,sur laquelle figure aussi tous ces sites (d'où sont nom probablement) va plutôt permettre de "choisir" les enzymes de restrictions qu'on va utiliser en fonction de l'endroit où on veut couper.

Exemple de situation : on a un vecteur qui fait 2000pb et on s'attend à avoir un insert qui fait 200pb s'il est pas muté et 150pb s'il est muté (une mutation qui aurait fait sauter un exon par exemple)

Si on choisit EcoRI et SmaI qui, selon la notice, coupe 2 fois le vecteur : EcoRI à 100pb et Sma I à 500pb. On te dis aussi que l'insert est inséré en position 200 sur le vecteur.

Cf. Schéma

-> On met nos enzymes, et on fait migrer les fragments par électrophorèse. Il s'avère qu'on observe alors 2 fragments sur le gel : un de 600pb et l'autre 1600pb

-> et là tu déduis quoi ? 1) Notre insert est intact
2) maiq surtout il fait 200pb donc cet allèle de notre patient n'est pas muté !

C'est mieux ?

[lympho6mon B]

Oui, parfait, c'est ce que j'avais voulu dire, Merci beaucoup !