Coucou,
Alors pour reprendre un peu tout ça, initialement on a voulu séquencer au niveau de l'ADN de l'enfant, ses allèles du gène WFS1 et il s'est avéré que :
-on a trouvé une substitution au niveau d'un allèle (c'est en fait l'allèle paternel)
-mais la maternelle
paraissait sauvage or comme l'enfant présente les signes cliniques et que la mutation est autosomiques récessive si l'enfant est vraiment malade comme les signes cliniques le suggére il faut nécessairement un deuxième allèle.
on continue alors nos recherches
Comme la séquence d'ADN paraît normale chez la mère on décide d'examiner la séquence de l' ARN messager qui est plus représentatif de ce que va être la protéine finale.
À ce moment là on réalise les étapes suivantes :
-extraction des ARNm
-obtention d'un ADNc
-PCR puis Séquençage de ces ADNc
Résultat du séquençage: les deux AR n'étaient apparemment pas de la même taille étant donné que le séquençage était illisible
à partir d'une certaine position = tout va bien on arrive à lire et puis d'un coup ça se chevauche.
Et là on va établir une
hypothèse, et nos expériences suivantes serviront à la confirmer ou non :
On a alors supposé qu'un des deux ADNc (et donc ARNm) était plus long que l'autre à cause d'une séquence qui aurait été rajoutée à l'épissage. Une séquence normalement enlevée à l'épissage car non codante, un intron, aurait été inclu dans l'ARNm, devenant alors codant et faussant le message de l'ARNm et donc produisant une mauvaise protéine Wolfram non fonctionnelle.
De par les connaissances du génome qui nous ont été donner d'avoir en Biomol, on sait que ce phénomène est possible si l'épissage se fait aux mauvais endroit comme par exemple si le site d'épissage (nucléotide AG) est décalé à cause d'une substitution de nucléotide et que du coup le spliceosome épisse plus loin que ce qu'il ne fallait et englobe un intron.
Cf. schéma ci dessous.
C'est une hypothèse, rien ne nous dis que ce décalage est dû forcément à ça ! Donc on fait un clonage moléculaire pour isoler nos deux allèles (mélangés dans le cytoplasme de l'enfant) et pouvoir séquencer l'allèle maternel (rappel : au niveau du père on a déjà trouvé la mutation qui était en cause).
En comparant la séquence ARNm mutée de la mère et un contrôle sain on se rend compte qu'il y'a effectivement une séquence en plus. Et 1) avec la position nucléotidique à partir de laquelle il y a un surplus de nucléotides, 2) comme on a séquencé tout le génome humain on peut identifier que c'est un intron (l'intro entre exon 6 et 7 dont on connaît la séquence du coup) qui à été rajouté à l'épissage. De plus on pourra retrouver juste après cet intron le fameux site cryptique d'épissage qui est en cause !
Notre hypothèse est validé.
Cet intron en plus qui produit un ARNm et une protéine mutée + la mutation paternelle explique que l'enfant ai ces signes cliniques -> il est diagnostiqué malade.
J'ai répondu à peu près clairement à tes questions ?
