NGS PCR clonale

[Ryuk]

Salut, j'ai beaucoup de mal avec cette partie, je comprend pas pourquoi on dénature plusieurs fois et pourquoi on ajoute les primers les uns après les autres... je vois pas trop l'utilité je veux bien une petite explication svp merciiii

[Ryuk]

du coup ?

[AnNévrisme]

Coucou

Alors en fait les but de cette PCR en émulsion vont être :

-de multiplier le fragment présent dans le microréacteur

-ajouter une séquence en 3' qui puisse être complémentaire des séquences sur la sphère afin que le fragment se fixe par complémentarité à la sphère et pouvoir ensuite mettre une sphère par puit dans la puce à NGS.

-ajouter aussi en 5' du fragment une amorce biotinylée afin de pouvoir récupérer les sphères ayant bien fixée les fragments (et ne pas mettre dans les puits des sphères sans fragments -> on n'aurait rien à séquencer) grâce à la complémentarité biotine streptavidine
----> on utilise des billes magnétique recouverte de streptavidine, elle va se lier à la biotine et donc aux sphères. Avec un aimant on récupérera seulement les sphères attachées aux billes magnétique (et donc si elles se sont attachees c'est grâce à la biotine et grâce au fragment, résultat on a bien récupéré nos sphères avec fragments).

On réalise pour cela les mêmes étapes qu'une PCR classique : dénaturation hybridation et élongation
Seulement ici les étapes sont détaillées car on va hybrider des amorces complémentaire aux adaptateurs avec des particularités (biotine ou séquence similaire à la sphère)

Je sais pas si j'ai vraiment répondu à ta question ?