Entraînement méthodes d'étude des protéines

[Debo]

Entraînement pour demain et après.
Prenez quelques minutes pour trouver vos réponses.
Regardez les corrections et revenez dessus, vous devez savoir le refaire.
Aidez-vous de votre fiche pour comprendre les corrections.
Bon courage !

(I, II, III et IV sont des exercices et V n'est qu'une explication.)


ANAKINE

I) a) Quel est son pHi ?
b) A pH physio (pH = 7,4), quelle est sa charge nette ?

II) On fait 3 groupes de peptides ANAKINE.
1) 1° groupe :
a) Pour connaître uniquement la composition en AA du peptide, quelle méthode utilise-t-on ?
b) Sur une courbe représentant la proportion de chaque AA obtenu,
chaque pic correspond à un AA particulier (un pic pour l'alanine etc)
2 pics sont plus grands que les autres.
A quels AA correspondent-ils ? De combien de fois sont-ils plus grands ?

2) 2° groupe :
Pour connaître la séquence en AA du peptide, qu'utilise-t-on ?

3) 3° groupe :
a) On fait subir une digestion trypsique au peptide. Combien de peptides obtient-on ?
b) Combien y a-t-il de fonctions ionisables sur chacun des peptides obtenus ?

III) Pour les parties III et IV, on utilise les peptides obtenus après la digestion trypsique (sauf quand c'est indiqué).
a) Electrophorèse par gradient de pH :
(gradient de pH = pH augmente de l'anode à la cathode :
pH les plus acides à l'anode et les plus basiques à la cathode)
Quel peptide retrouve-t-on le plus proche de l'anode ? de la cathode ?
(Aidez-vous des pHi.)

b) Après SDS-PAGE, lequel est le plus proche de l'anode ?

c) Electrophorèse bidimensionnelle :
On utilise les peptides ANAK et AANAK (le pHi est le même !)
Après SDS-PAGE, lequel aura le moins migré vers l'anode du SDS-PAGE ?

Réponses :
I) Méthode des bols :
a) pHi = 6,95
b) à pH = 7,4, charge nette nulle

II) 1a) hydrolyse acide
1b) à A et D (N est devenu D), les pics sont 2 fois plus grands, puisqu'il y a 2 fois plus d'A et de N dans le peptide que des autres AA

2) PITC = réactif d'Edman

3a) On obtient 2 peptides : ANAK et INE (trypsine coupe à droite de R et K)
3b) 3 fonctions ionisables pour chaque peptide (on "récupère" le COO- de K et le NH3+ de I)

III) a) On n'est pas obligé de calculer les pHi de ces peptides, les 2 ont NH3+ et COO-
et le seul AA à chaîne latérale ionisable est de type différent : K est basique, E est acide.
pHi sera donc plus basique pour ANAK (pHi = 10,05) que pour INE (pHi = 3,3).
INE sera le plus proche de l'anode qu'ANAK qui sera plus proche de la cathode.

b) INE est le plus léger et aura le plus migré.

c) AANAK est le plus lourd et aura moins migré.


Prenez 5 min de pause.


IV) Chromatographies sur colonne échangeuse d'ions :
1) Par variation de pH :
Il existe 2 types de colonnes échangeuses d'ions :
a) Echangeuse de cations :
Billes donc chargées -. On commence à pH hyper-acide (pour que tous les peptides soient chargés +)
On augmente le pH.
Dès que pH = pHi d'un des peptides, il se détache (on dit que le peptide est élué par le passage de la solution qui augmente le pH).
Si on met nos 2 peptides, lequel est élué en 1° ?

b) Echangeuse d'anions : c'est l'inverse
Billes donc chargées +. On commence à pH hyper-basique.
On diminue le pH.
Si on met nos 2 peptides, lequel est élué en 1° ?

2) Par compétition : avec NaCl (Na+, Cl-) (par exemple)
On utilise les 2 mêmes types de colonnes échangeuse d'ions :
a) Echangeuse de cations :
Billes chargées -. Ajout de NaCl : Na+ prend la place des peptides sur les billes.
Les peptides sont tous chargés +, mais ceux qui le sont le moins ont tendance à être élués en 1°.
A pH = 7,4, est-ce ANAK ou KANAK qui est élué en 1° ?

b) Echangeuse d'anions : c'est l'inverse (Cl- prend la place des peptides etc)
A pH = 7,4, est-ce INE ou DINE qui est élué en 1° ?

Réponses :
IV) 1a) INE
1b) ANAK
2a) ANAK (toujours pas besoin de calculer le pHi, K étant un 2° basique)
2b) INE

V) Chromatographie par affinité :
Sur une colonne de billes sur lesquelles est fixé un anticorps (AC) spécifique ou un substrat (S) de la protéine,
on verse un mélange de protéines.
Celles à qui correspondent l'AC spécifique ou le S se lient aux billes.
Les autres sont éluées.
Ensuite on verse une solution très concentrée de l'AC spécifique ou du S.
Les protéines se détachent alors des billes pour se lier aux AC spécifiques ou aux S de la solution,
car leur affinité augmente avec la concentration.

VI) Spectrographie de masse :
exo si R. Mengual insiste en cours

[Charly]

On fait " DARK VADOR" maintenant ? Merci beaucoup pour cette aide a nos révision. ++

[paulinec]

Pour ANAKINE, ou meme DARK VADOR, on ne nous donne pas les pKa dans les QCM?

[P-A]

On fait " DARK VADOR" maintenant ? Merci beaucoup pour cette aide a nos révision. ++

N'importe quoi, ya pas de O dans les AA... Allez retourne les réciter à l'envers, puis à l'endroit... Non mais !

....

Sinon sympa comme exos, ça permet de voir ce qui peut tomber