multiples questions ^^

[nouchka]

Bonsoir (bonjour?) !

alors j'ai une petite question, ou 2 plutôt ^^

- lyse des GR avec un solution isotonique ?? c'était bien écrit sur la diapo et la prof l'a dit mais ça serait pas plutôt HYPOTONIQUE? car isotonique ça fait rien... et dans le bouquin de référence il y a écrit hypotonique, donc simple erreur de la prof je suppose?

- p.5 de la ronéo il y a écrit que pour l'électrophorèse il fallait mette : marqueur de PM, produit PCR de l'ADN du foetus, produit PCR d'un patient non atteint et témoin négatif. Je comprends tous leur utilité sauf le produit PCR du patient non atteint. Le marqueur de PM n'est pas suffisant en temps qu'échelle pour la comparaison?

Merci d'avance pour les explications !

[edit du titre car plus de questions plus bas ^^]

[Cél0u]

salut!!
Je suis dsl je ne sais pas répondre à ta première question, en revanche pour la deuxième il me semble qu'il est toujours nécessaire de comparer un individu sain d'un individu malade. L'individu sain étant la séquence de référence (p11 de la ronéo). Elle permet directement de voir si la séquence étudié est anormale ou pas.
Le marqueur de poids est présent uniquement pour avoir une échelle de poids moléculaire. En gros, une bande du puits "marqueur de poids moléculaire" = poids moléculaire précis et toute les bandes qui correspondent à celle-ci ont le même poids.
Voila, c'est ce que j'ai compris mais bon je ne suis pas une experte donc si je me trompe corriger moi...

[nouchka]

ouai je vois je crois... merci

il reste toujours une question sans réponse si une âme charitable passe par là :p

et j'en rajoute quelques unes encore XD :

1) pour le séquençage : comme l'ADNpol intègre des ddNTP de manière aléatoire comment on sait si les différentes ddNTP ont bien été intégrées à tous les niveaux? donc s'il ne nous manque pas un nucléotide dans notre séquence ? (je sais pas si c'est très clair ce que je dis ...)

2) pour le clonage : par rapport à l'origine de réplication pourquoi la multiplication de l'ADN recombinant peut être plus rapide que la réplication bactérienne vu qu'elle utilise sa machinerie?

3) j'ai pas bien compris comment on isolait les colonies ? en fait je crois que c'est pas vraiment expliquer (ou alors j'ai vraiment rien compris ^^) parce que p.10 il est dit qu'une colonie provient d'une bactérie et que la colonie est isolée mais ils disent pas comment... et ça m'intrigue pour la suite de la manip' ^^

4)p.9 il est dit que les bords francs ont de proba de se refermer sans l'insert mais perso ça me semble bizarre, il me semble que c'est plutôt pour les bouts cohésifs (d'ailleurs je crois que c'est ce qui avait été dit non? mais je suis pas du tout sure) vu qu'il n'ont pas besoin de ligase (et quelqu'un à vérifier pour moi dans le livre de référence et il semblerait que ce que je dit est la bonne version mais du coup je comprends pas trop l'utilité des ligases) donc si quelqu'un pouvait juste réexpliquer simplement ce petit passage ça serait chouette !

voilà voilà j'ai plus de questions il me semble ^^

ça serait chouette qu'un tut' réponde (mais je ne crache pas sur les réponses de quelqu'un d'autre s'il y en a !)

merci merci

[Alex Kaisui]

1) pour le séquençage : comme l'ADNpol intègre des ddNTP de manière aléatoire comment on sait si les différentes ddNTP ont bien été intégrées à tous les niveaux? donc s'il ne nous manque pas un nucléotide dans notre séquence ? (je sais pas si c'est très clair ce que je dis ...)
j'en suis pas certain, mais je pense que grâce à l'amplification de l'ADN par PCR tu as tellement de brins que toutes les possibilités de réplications prématurément stoppées par un ddNTP existent (là on rentre dans de la proba et UE4 on en a fini avec ^^)

2) pour le clonage : par rapport à l'origine de réplication pourquoi la multiplication de l'ADN recombinant peut être plus rapide que la réplication bactérienne vu qu'elle utilise sa machinerie?
en fait la réplication bactérienne est assurée selon des cycles contrôlées, comme la mitose d'une cellule eucaryote (cf. GILSON), donc la réplication de l'ADN bactérien est placée dans un laps de temps plus ou moins contrôlé, tandis que la multiplication du plasmide ne fait pas partie de cette régulation, donc se multiplie sans arrêt ^^

3) j'ai pas bien compris comment on isolait les colonies ? en fait je crois que c'est pas vraiment expliquer (ou alors j'ai vraiment rien compris ^^) parce que p.10 il est dit qu'une colonie provient d'une bactérie et que la colonie est isolée mais ils disent pas comment... et ça m'intrigue pour la suite de la manip' ^^
on peut isoler les colonies qui ont intégré l'insert et celles qui ne l'ont pas fait grâce au gène de la bêta-galactosidase présent dans le polylinker, enzyme qui clive le X-GAL, substrat incolore devenant bleu une fois clivé : si l'insert est bien intégré ce gène est interrompu donc colonie incolore =)
en ce qui concerne le fait d'isoler les colonies avec allèle muté ou sauvage, ça c'est pas dit, mais on fait la différence à la toute fin une fois l'ADN extrait grâce à un séquençage permettant de voir quel type de mutation est présent...

4)p.9 il est dit que les bords francs ont de proba de se refermer sans l'insert mais perso ça me semble bizarre, il me semble que c'est plutôt pour les bouts cohésifs (d'ailleurs je crois que c'est ce qui avait été dit non? mais je suis pas du tout sure) vu qu'il n'ont pas besoin de ligase (et quelqu'un à vérifier pour moi dans le livre de référence et il semblerait que ce que je dit est la bonne version mais du coup je comprends pas trop l'utilité des ligases) donc si quelqu'un pouvait juste réexpliquer simplement ce petit passage ça serait chouette !
c'est très bien expliqué par là : http://www.carabinsnicois.fr/phpbb/viewtopic.php?f=188&t=14952 ^^

[nouchka]

merci

[WatiGG]

lyse des GR avec un solution isotonique ?? c'était bien écrit sur la diapo et la prof l'a dit mais ça serait pas plutôt HYPOTONIQUE? car isotonique ça fait rien... et dans le bouquin de référence il y a écrit hypotonique, donc simple erreur de la prof je suppose?

Coucou, je confirme, elle l'a avoué à demi-mot, j'ai entendu quelqu'un lui demander en fin de cours. C'est bien une erreur!

[léo]

Alex's on the fire!
Quelques précisions cependant :

1) pour le séquençage : comme l'ADNpol intègre des ddNTP de manière aléatoire comment on sait si les différentes ddNTP ont bien été intégrées à tous les niveaux? donc s'il ne nous manque pas un nucléotide dans notre séquence ? (je sais pas si c'est très clair ce que je dis ...)
j'en suis pas certain, mais je pense que grâce à l'amplification de l'ADN par PCR tu as tellement de brins que toutes les possibilités de réplications prématurément stoppées par un ddNTP existent (là on rentre dans de la proba et UE4 on en a fini avec ^^)

Exact: on amplifie avec 40 cycles PCR : on arrive à avoir 2^40= 1000 miliards d'amplicons... Or tu amplifie des séquences de quelques miliers de nucléotides. Le hasard ne serait vraiment pas cool d'oublier une base sur tout ça : tu a en moyenne 1 miliard d'amplicon pour une base!

2) pour le clonage : par rapport à l'origine de réplication pourquoi la multiplication de l'ADN recombinant peut être plus rapide que la réplication bactérienne vu qu'elle utilise sa machinerie?
en fait la réplication bactérienne est assurée selon des cycles contrôlées, comme la mitose d'une cellule eucaryote (cf. GILSON), donc la réplication de l'ADN bactérien est placée dans un laps de temps plus ou moins contrôlé, tandis que la multiplication du plasmide ne fait pas partie de cette régulation, donc se multiplie sans arrêt ^^
NON, chez les bactéries c'est très différent: Les bactéries ont naturellement ce qu'on appelle des épisomes, c'est a dire des petits bouts d'ADN en dehors des chromosomes, qu'on appelle aussi des plasmides! C'est physiologique chez les bactéries d'avoir des plasmides qu'elles veulent amplifier au maximum pour les faire passer aux bactéries voisines (cf plasmides de résistance aux antibio). Si on réfléchit de manière finaliste, ce serait pas très interessant pour elle de répliquer ces plasmides que quand elle se divise...! Donc pour palier à ca, la bactérie a un système de régulation propre au chromosome, et tout le reste de l'ADN qui contient une origine de réplication appropriée se réplique de manière constante tout au long du cycle. En biomol, on exploite cette capacité en intégrant nos plasmides artificiels avec une origine de réplication adaptée.

3) j'ai pas bien compris comment on isolait les colonies ? en fait je crois que c'est pas vraiment expliquer (ou alors j'ai vraiment rien compris ^^) parce que p.10 il est dit qu'une colonie provient d'une bactérie et que la colonie est isolée mais ils disent pas comment... et ça m'intrigue pour la suite de la manip' ^^
on peut isoler les colonies qui ont intégré l'insert et celles qui ne l'ont pas fait grâce au gène de la bêta-galactosidase présent dans le polylinker, enzyme qui clive le X-GAL, substrat incolore devenant bleu une fois clivé : si l'insert est bien intégré ce gène est interrompu donc colonie incolore =)
en ce qui concerne le fait d'isoler les colonies avec allèle muté ou sauvage, ça c'est pas dit, mais on fait la différence à la toute fin une fois l'ADN extrait grâce à un séquençage permettant de voir quel type de mutation est présent...

NON, Ce ne sont pas les colonies qu'on isole, ce sont les BACTERIES. En bactério, on a une technique avec un protocole très simple pour isoler chaque bactéries les unes des autres sur une boite de pétri. (photo: http://www.inra.fr/var/plain/storage/htmlarea/1802/PetriPhase2.jpg. C'est utilisé en routine pour toute culture bactérienne et ca marche très bien : tu es sure que chaque bactérie est isolée des autres (quand on dit isolé c'est séparé avec de la place autour d'elle pour croite tranquille). chaque bactérie peut alors se diviser et former une colonie que tu vois très bien sur une boite de pétri. (photo: http://www.microbe-edu.org/etudiant/imgcory/col3.jpg: chaque petit point blanc est UNE colonie issue d'UNE bactérie.)


4)p.9 il est dit que les bords francs ont de proba de se refermer sans l'insert mais perso ça me semble bizarre, il me semble que c'est plutôt pour les bouts cohésifs (d'ailleurs je crois que c'est ce qui avait été dit non? mais je suis pas du tout sure) vu qu'il n'ont pas besoin de ligase (et quelqu'un à vérifier pour moi dans le livre de référence et il semblerait que ce que je dit est la bonne version mais du coup je comprends pas trop l'utilité des ligases) donc si quelqu'un pouvait juste réexpliquer simplement ce petit passage ça serait chouette !
c'est très bien expliqué par là : http://www.carabinsnicois.fr/phpbb/viewtopic.php?f=188&t=14952 ^^

Voilà! salut les loulous.

[Alex Kaisui]

Merci pour les précisions léo, je ne connaissais pas cette particularité de transcription des bactéries ^^
D'ailleurs en parlant d'elles, j'ai utilisé le mot "colonies" en abus de langage mais j'avais compris comme tu l'as expliqué, heureusement que tu passes par là pour faciliter la compréhension