NGS

[Anaisrcc]

Bonjour,
J'ai eu des problèmes à comprendre le fonctionnement de la technique NGS :

Lors de la récupération du fragment d'ADN par la streptavidine, c'est bien tout le brin qui est récupéré ou c'est juste la partie associée à la sonde ? La sonde sert donc juste à repérer le brin d'intérêt, puisque après elle est dégradée ?

Concernant l'amplification, on peut dire que c'est une phase qui permet de créer un brin qui puisse "s'associer" avec les primers de la sphère ? pour ensuite récupérer la sphère? Et quel est l'intérêt de récupérer la sphère avec plusieurs brins ? pour avoir plusieurs versions qui seront contrôlées lors du séquençage ? Le séquençage fera donc une sélection du meilleur brin? En quoi cette amplification est-elle plus rapide ? parce que c'est ordonné sur un microréacteur ?
Pouvez-vous réexpliquer l'image des gouttelettes eau/huile ?

A quoi servent les primers libres?
Et la PCR clonale correspond à quoi exactement ? qu'est-ce qui différencie avec la PCR ? est-ce la présence de la sphère qui différencie ?


désolé pour toutes ces questions, peut-être bêtes ou expliquées dans le cours, mais j'ai peur de mal comprendre, je préfère être sure.

j'espère aussi que c'est le bon endroit où écrire.

Bonne journée et merci d'avance

[Nucléodrey]

Salut Anaïs,

Tout d'abord attention à ne pas confondre brin et fragment. Un fragment c'est un morceau d'ADN double brin . Donc l'ADN est composé de 2 brins reliés par des liaisons hydrogènes. C'est l'association des 2 brins qui donne le fragment.

Lors de la récupération des brins/fragments d'intérêt, c'est bien tout le brin qui est récupéré comme sur le schéma de la fiche et pas seulement la zone hybridée.( La sonde sert à récupérer le brin comme si c'était un crochet ). La sonde sert à sortir le brin d'intérêt du mélange d'ADN et lorsque tout est séparé on dégrade la sonde pour ne garder que le brin d'ADN d'intérêt.

Pour l'amplification : Effectivement, on peut dire qu'on rallonge un peu le brin pour qu'il puisse s'accrocher sur la sphère. Ensuite on récupère la sphère avec tous les brins identiques. Lors de l'étape de séquençage, on a alors une sphère dans chaque puit avec plusieurs fois le même fragment. Donc on va pouvoir séquencer plusieurs fois le même fragment et augmenter la profondeur (et donc la fiabilité) du séquençage. On peut dire qu'on contrôle le séquençage mais pas qu'on sélectionne un brin: ils seront tous séquencés les uns après les autres.
La phase d'amplification n'est pas spécialement rapide c'est surtout le séquençage qui permet de gagner du temps parce que le brin est séquencé jusqu'au bout, en entier ( contrairement au séquençage Sanger ou Sanger automatisé).
Les microréacteurs ce sont des gouttelettes (des billes liquides) d'une émulsion eau huile ( tape " émulsion eau huile " sur google et tu verras cette structure en billes. On réalise notre amplification là dedans.

Les primers libres servent à allonger le fragment pour qu'il puisse contenir une bille de biotine d'un côté et être accroché sur la sphère de l'autre. De plus, primer= amorce.

La PCR et l'amplification clonale/PCR clonale sont 2 notions super importantes à différencier. La différence n'est pas due à la présence de la sphère mais à l'ordre des étapes.
PCR: On se sert des 2 amorces pour ne réaliser une amplification que de la région du fragment qui nous intéresse.
Amplification clonale ( NGS) : D'abord on sélectionne les fragments d'intérêt avec les sondes ARN PUIS on les amplifie TOUS et EN ENTIER.

N'hésites pas à poser d'autres questions ou à demander des précisions si tu en as besoin, c'est le bon endroit et je suis là pour expliquer.
Bonne journée

[Anaisrcc]

Merci beaucoup ! c'est plus clair maintenant