Salut Aleeex !
(lire l'explication qui va suivre avec au moins les diapos du prof sous les yeux, et pourquoi pas la ronéo)
Alors le but de la manip, c'est d'
obtenir des souris dont toutes les cellules ont intégré le transgène qu'on a préparé en labo. Ici on
invalide un gène (KO) Comme ça on pourra ensuite étudier ce que fait ce transgène sur l'organisme de la souris comme si c'était une mutation qu'elle avait depuis sa naissance.
Donc ici, question qu'on se pose et qu'on veut résoudre en faisant cette expérience c'est :
qu'est ce que ça va faire si on invalide un certain gène ?Attention, le transgène s'insère sur un des deux chromosomes homologues choisis (je rappelle qu'on a fait une intégration ciblée), donc on aura des
hétérozygotes. Je reviendrai sur l'histoire des gènes létaux à la fin.
Donc première étape, on fait une
intégration ciblée de notre transgène dans une
CSE. On
intègre ensuite cette CSE dans le
blastocyste.
Du coup, au fur et à mesure du développement embryonnaire, certaines cellules proviendront de la division de la CSE modifiée et auront le transgène dans leur ADN. D'autres cellules proviendront de la division de cellules du blastocyste non modifiées et n'auront pas le transgène dans leur ADN.
On a donc une
souris mosaïque.Le
but, c'est de faire en sorte que les
cellules germinales (ovocytes ou spermatozoïdes) de la souris soient des cellules provenant de la CSE modifiée, qu'elles
soient des cellules comportant le transgène. (Je rappelle que les cellules germinales seront quand même hétérozygotes pour le transgène).
Dans la deuxième étape, on choppe une souris qui a des cellules germinales comportant le transgène. Cette souris, on la fait s'accoupler avec une souris normale (sauvage). La c'est de la génétique mendélienne de base, comme au lycée.
A=gène sauvage / a=transgène
Cellule germinale de la souris mosaïque :
---A------
---a-------
Cellule germinale de la souris sauvage :
---A------
---A------
Quand tu croises tout ça, on va avoir
2 cellules oeufs de génotype
(A;A) pour
2 cellules oeufs de génotype
(A;a). D'où le
50%.Ici ce sera la
souris entière qui aura le transgène, puisque le transgène est présent dès la cellule oeuf ! On n'aura
pas de souris mosaïques.Par contre, nous
on veut des homozygotes parce que le plus souvent les mutations (ici le KO) sont récessives (sauf dans les cas d'haplo-insuffisance, voir p8 de la ronéo, la fin de la deuxième étape).
Pour la troisième étape du choppe deux souris hétérozygotes pour le transgène et tu les fais s'accoupler.
Les deux génotypes sont (A;a) et quand tu les croises tu obtiens
1 souris (A;A) pour
une souris (a;a) pour
2 souris (A;a). D'où le 25%. Je répète, ca vient de la redistribution au hasard des chromosomes durant la méiose. Si tu veux plus de détail dis le moi, je te ferai un petit rappel de terminale (qui ne sera d'ailleurs pas un rappel si tu viens d'une autre filière que S).
Donc là c'est gagné, on va pouvoir étudier nos
souris homozygotes (a;a), donc avec le transgène, donc le KO.
Pour l'histoire des gènes létaux :Dans certains cas, tu te rends compte qu'
à la fin de l'étape 3 tu n'obtiens
pas les 25% de souris homozygotes.
Qu'est ce que ça veut dire ?Grâce à la recombinaison aléatoire, normalement on est obligé de les obtenir ces 25%. Donc en fait, ça veut dire que ces
25% sont morts avant de naître. 
On en déduit donc que le
gène qu'on a invalidé était
nécessaire pour le développement embryonnaire. On pourra donc ensuite faire des expériences pour essayer de trouver à quel moment du développement embryonnaire ce gène intervient. On peut aussi
étudier quelles sont les
conséquences de l'invalidation de ce gène mais seulement au
niveau cellulaire. (Bah oui, au niveau de l'animal on peut pas l'étudier parce que l'animal n'existe pas, il meur trop tot.)
Pour ça on va récupérer des c
ellules chez l'embryon à des stades très précoces (avant qu'il meurt) et on va faire
se différencier ces cellules
en fibroblastes (MEF). Ces fibroblastes on les
cultive ensuite sur une boîte de pétri comme on sait faire et on peu
regarder quelles seront
les conséquences du knock out du gène en question sur une cellule.
Voilà, j'espère que c'est clair et que cette explication t'éloigne un peu du gouffre !
Surtout ne rien lacher, courage ! Si c'est pas clair redemande.
j'vois pas trop pourquoi on obtient tous ces pourcentages a l'issu des différents croisements, ( comment ca se fait qu'on en a que 25 % a la fin ? Oo ) ni meme, pourquoi on fait ca ? xD ca sers uniquement à savoir si un gène est létal ? Et j'vois pas trop ce qu'on fait avec les MEF… :/
