Ronéo 10 Immunoprécipitation

[Aïki]

EDIT -Alexis : vous avez juste en-dessous une très belle explication d'Ondine sur l'immunoprécipitation !!!

Salut,

Au risque de paraitre bête, je voulais demander un récapitulatif, une explication de l'immunoprécipitation parce que je n'ai pas vraiment compris

Merci d'avance

[Ondine]

Salut ! Alors je vais essayer de faire un peu plus clair que dans la ronéo :

-> Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)

Son objectif c’est de savoir, quel type de nucléosome (et quel type DE MODIFICATION D'HISTONES) est présent sur quel endroit du génome.
Par exemple, on veut voir les gènes qui sont exprimés en sélectionnant les méthylations en K4 de H3 car on sait que cette modification des histones est associée à l'activation de l'ADN

On va pouvoir cartographier les modifications d'histones (= de la chromatine) sur l'ADN (=code des histones)

1. On part de la cellule (et pas de l’ADN) et on fige la cellule (c’est très classique) forme des liaisons covalentes protéines-protéines et ADN-protéines grâce au formaldéhyde Ceci est réversible en modifiant la température.

2. On achète/génère des anticorps spécifiques d'une modification d'histones (exemple une méthylation / acétylation d'une lysine/arginine sur H3/H2 ...) . Les nucléosomes (formés par les histones) sont différents car il ont subit des modifications POST-TRADUCTIONNELLES différentes.

3. On fait une immunoprécipitation. On crée des complexes immuns spécifiques (notre anticorps + la modification de la chromatine associée).
ICI C'EST LE POINT DELICAT : On va récupérer l'ADN associée à sa chromatine QUI A PRECIPITE ! Donc seulement l'ADN qui possède la chromatine qui possède la modification qu'on recherche. Ce qui ne précipite pas est retiré ! (on élimine le surnageant).

Donc à ce moment, on se retrouve avec des fragments d'ADN+chromatine qui possèdent TOUS (au moins une fois sur le fragment, pas forcément tous les nucléosomes du fragment) la modification d'histones qu'on a sélectionné. C'est pour cela qu'on dit que notre ADN est ENRICHIT en modification K4H3.
Proportionnellement la quantité de modification K4H3 sur notre ADN (après immunoprécipitation) est beaucoup plus grande, on a par exemple 90 % de la chromatine qui a la modification, alors qu'avant c'était 20 % (à ce moment on avait TOUT l'ADN, on en avait pas viré la moitié par l'immunoprécipitat)

4. On reverse le pontage et on purifie l’ADN (on enlève les anticorps). On s'aperçoit que l’ADN est de composition différente comparé à l’ADN contrôle avant l’immunoprécipitation (= InPut).
On regarde après l’immunoprécipitation, ce qui a été enrichit : ce sont les fragments d’ADN qui ont la modification recherchée sur les nucléosomes

On sélectionne DE l’ADN A PARTIR de modifications DES NUCLEOSOMES. On sélectionne la modification nucléosomale qu’on veut, et à partir de ça, on récupère l’ADN qui a de la chromatine qui porte cette modification.

Comment visualiser cet ADN ?

-> On peut faire par hybridation, avec une sonde contre cette région, et on regarde après hybridation si la sonde est enrichit dans l’immunoprécipat par rapport à l’input
Exemple : On a le gène de la ß-globine, on veut s'avoir si il s'exprime, et on sait que la chromatine doit porter une modification K4H3 pour que le gène soit exprimé. On fait l'immunoprécipitation.
On prend l'ADN après immunoprécipitation : on envoie la sonde fluorescente qui correspond à la séquence du gène de la ß-globine
On prend l'ADN contrôle (InPut), on fait la même chose
Si la fluorescence est la même dans les 2 cas, c'est que ce gène n'a pas été enrichit

-> Par la réaction PCR, qui permet d’amplifier des séquences spécifiques d’ADN, qu’on peut rendre quantitatif, et permet de déterminer très précisément la quantité d’ADN enrichit. Ceci implique qu’on connaisse la région qui nous intéresse. Parfois on ne le sait pas, ce qui nous intéresse ce sont des profils globaux au niveau du génome

-> On peut avec nos machines de séquençage séquencer le génome, on séquence l’immuno-précipitat par rapport à l’Input. C’est une méthode : le Chip-Sec (combinaison Chip et séquençage haut débit)

-> On peut exprimer un rapport Rip.
Rip = Quantité du fragment PCR qui nous intéresse DANS L’IMMUNOPRECIPITAT / quantité totale d’ADN de la réaction
Donc plus la modification qu’on a sélectionné dans notre ADN est répendue, plus le rapport va être grand.

Un autre rapport
Rc = Q fragment PCR qui nous intéresse (LE MEME) dans l’Input / quantité totale d’ADN de la réaction

On a un enrichissement si Rip > Rc
On parle d’un facteur d’enrichissement = Rip / Rc

C'est exactement pareil que pour l'exemple de la ß-globine. On va prendre un truc plus concret.
- L'ADN c'est les 1000 étudiants en P1 = l'ADN TOTAL
Dedans, il y a 550 filles. Les filles c'est le fragment PCR = la modification qu'on recherche
Donc on peut déjà faire le Rc = 550 / 1000 = 0,55

On envoie "un anticorps" qui sélectionne quelque chose que portent toutes les filles. Et on vire tous les autres (donc tous les mecs). Comme certaines filles sont en couples, elles viennent avec leur mec.
C'est pour cela qu'à la fin on a environ 600 personnes, dont les 550 filles.
Là, on peut exprimer le rapport Rip Rip = 550 / 600 = 0,92

Le facteur d'enrichissement = 0,92 / 0,55 = 1, 72
On a un facteur d'enrichissement supérieur à 1. Donc ça veut dire que l'anticorps qu'on a envoyé sélectionne bien mieux les filles que les garçons.
OU : L'anticorps qu'on a envoyé reconnait mieux la chromatine portée par le gène d'intérêt que la chromatine du reste de l'ADN.


Fiouu, mon exemple est un peu bizarre à la fin, mais bon, peut-être ça peut vous aider quand même !

Allez, travaillez bien

[Aïki]

Waa merci Ondine pour cette superbe explication !!!!!
et l'ex de le fin m'a permis de comprendre merci encore !!

[Flibu]

Petites précisions pour le 4. :
Quand on reverse le pontage et que l'on purifie l'ADN, on enleve les proteines d'histones par la meme occasion, non? (c'est peut etre sous entendu dans ton explication mais je demande confirmation ^^)

Aussi, lorsque l'on fragmente notre chromatine apres Pontage par la formaldehyde, comment se fait exactement cette fragmentation?
Je veux dire, est ce qu'un fragment correspond a un domaine délimité par les insulateurs, ou bien c'est du au hasard?

[Ondine]

Salut !

Oui quand on reverse le pontage et qu'on purifie l'ADN on vire toute la chromatine, et donc les protéines histones.
La fragmentation se fait au hasard par centrifugation, et pas par rapport aux domaines délimités par les insulateurs !

Voilou, travaille bien @+

[Flibu]

Merci bien Ondine!

[attention83]

Merci pour l'explication, mais j'ai une question toute bête pourquoi on est obligé de figer la cellule par un pontage ? Ca marcherait pas avec une cellule libre ?

[Mika]

Merci pour l'explication, mais j'ai une question toute bête pourquoi on est obligé de figer la cellule par un pontage ? Ca marcherait pas avec une cellule libre ?

Salut, j'aurais tendance a dire parce que si tu ne fixe pas ta cellule, le moindre petit choc va lui faire exprimer des gènes qui étaient off. Et comme le but est tout de meme d'étudier les gènes on/off à un moment donné, si tu ne fige pas ta cellule, tu ne pourra que suggérer que tel ou tel gène est on/off a tel moment donné !!

Voila j'espere ne pas m'être trompé

[Ondine]

C'est exactement ça Mika_ ! Merci de ton aide

Ps : Attention83 j'ai pas oublié ta question sur la condensine, dès que j'ai le temps de m'y pencher je te réponds mais pour l'instant je pense que c'est pas une priorité

[Mika]

C'est exactement ça Mika_ ! Merci de ton aide

No problem, en meme temps c'est la meilleure matière, jcomprends pas qu'il n'y ai pas plus de monde qui répond en BioC ^^

Tampis

[attention83]

Merci tous les deux

[Bat-to-fly]

Waouh !!! Merci pour cette explication Grâce à toi Ondine j'ai eu une révélation, en fait la bio cell c'est de la bombe ^^ et c'est pas si compliqué quand on reprend tranquillement !!!!
Merci et encore merci !!!!!!!

[-Alexis]

Up !

[MelB]

Si les fragments qu'on récupère après immunoprécipitation on tous "au moins une fois" la modif voulu. C'est qui les pots de colles de copains qui viennent avec leurs copines ? Des petits fragments vicieux qui ne l'avaient pas en fin de compte ?

PS : si quelqu'un pouvait faire un saut sur le post "ANNATUT BIOCELL" j'ai posté une petite question. Voila Merci d'avance
Bonnes fêtes !

[-Alexis]

Salut !

En fait, juste après avoir fixer la cellule, donc notamment après avoir fait des liaisons covalentes entre l'ADN et les nucléosomes, on va fragmenter et purifier la chromatine.
Ca veut dire qu'on va la découper en petit bouts (fragmentation) et "l'extraire" de la cellule ou plutôt virer de notre tube à essai tout ce qui n'est pas de la chromatine (purification).

Du coup, après on se retrouve avec des petits fragments d'ADN qui sont tous reliés à quelques nucléosomes (4 sur les diapos du prof). Sur les 4 nucléosomes, il y en aura au moins un qui parmi toutes les modifications qu'il a subit, possède la modification que l'on recherche.

Voilà le pourquoi du comment de l'incrustation de copains qui n'ont pas le modification ! En fait ce sont des nucléosomes qui sont liés à la portion d'ADN qui comporte un de ces nucléosomes avec la modification recherchée (hum hum, cette dernière phrase est moins claire mais normalement avec ce qui précède tu devrais comprendre ! )

Voilà, j'espère que c'est tout bon, si tu as d'autres soucis n'hésite pas !

Ps : ne t'en fait pas pour ton autre post, on est entrain de répondre à tous les posts sans réponses !

[MelB]

Au top merci

[Bès El]

Salut,


Il y a quelque chose qui me perturbe dans ton exemple Ondine sur les "étudiants". J'ai l'impression qu'en fait le Chip-Sec serait une sorte de sélection positive.

[-Alexis]

Salut Bès El !

Alors attention, ce n'est pas le chip sec qui est une sorte de sélection positive. Ce qu'on fait pour aller récupérer toutes les filles (et qui au passage récupère quelques garçons) correspond à l'étape 2 de l'expérience, soit celle-là :

2. On achète/génère des anticorps spécifiques d'une modification d'histones (exemple une méthylation / acétylation d'une lysine/arginine sur H3/H2 ...) . Les nucléosomes (formés par les histones) sont différents car il ont subit des modifications POST-TRADUCTIONNELLES différentes.

Et effectivement, ça ressemble à la sélection positive, sauf que dans la sélection positive, tu sélectionnes des cellules en fonction des Ag qu'elles ont à leur surface alors qu'ici tu sélectionnes de l'ADN en fonction des modifications post tradctionnelles qu'ont subit les histones liés à cet ADN.

Le chip-sec c'est simplement pour visualiser le résultat. Il existe d'autres méthodes comme le PCR quantitatif ou l'hybridation. Gilson n'a détaillé que l'hybridation parce que c'est le plus simple et vous la connaissez :

-> On peut faire par hybridation, avec une sonde contre cette région, et on regarde après hybridation si la sonde est enrichit dans l’immunoprécipat par rapport à l’input
Exemple : On a le gène de la ß-globine, on veut s'avoir si il s'exprime, et on sait que la chromatine doit porter une modification K4H3 pour que le gène soit exprimé. On fait l'immunoprécipitation.
On prend l'ADN après immunoprécipitation : on envoie la sonde fluorescente qui correspond à la séquence du gène de la ß-globine
On prend l'ADN contrôle (InPut), on fait la même chose
Si la fluorescence est la même dans les 2 cas, c'est que ce gène n'a pas été enrichit

Donc les 2 autres techniques ont aussi pour but de visualiser le résultat.
Le PCR quantitatif vous le verrez au s2.

Voilà, j'espère que j'ai été assez clair. A bientôt et bon courage !!