Coucou!!
Alors alors attention: lorsqu'on dit
l'intensité (de la fluorescence) des produits PCR générés est identique quelle que soit la quantité d'ADN génomique utilisée au départ c'est SEULEMENT à partir de 40 cycles +++. Le but de la PCR quantitative c'est justement que ce soit proportionnel!
Regarde ce schéma:
Tu peux voir que
la quantité de fluorescence au départ est trop faible donc
quasi pas détectable : c'est la 1ère phase de plateau.
Tout à droite,
à partir de 40 cycles, on observe une
deuxième phase de plateau : c'est le moment ou quelque soit la quantité d'ADN, l'intensité de la fluorescence restera la même car le
système sature.
Entre les 2, tu as une
montée de la fluorescence qui se fait progressivement avec le nombre de cycles. C'est la partie ou la fluorescence est proportionnelle à la quantité d'ADN présente.
En fait, le principe de la PCR en temps réel c'est de mesurer la fluorescence à chaque fin de cycle, puis 'établir cette courbe et mesurer la fluorescence au moment meme ou elle commence ce à monter (au moment du Ct) car c'est la que c'est proportionnel.
D'ou vient cette fluorescence?
Lors de l'hybridation l'agent intercalant (ex: SYBER GREEN) vient se mettre au niveau de l'ADN simple brin. On a ensuite l'étape d'élongation. Le SYBER GREEN ne sera fluorescent que lorsque l'ADN est
simple double brin, c'est à dire à la fin de l'élongation. On a donc autant de fluorescence que d'ADN double brin. Donc la quantité d'ADN produite est proportionnelle à la fluorescence.
Pour la sonde TaqMan le principe est le meme c'est juste la manière dont la sonde fonctionne qui est légèrement différente; C'est donc proportionnelle pour elle aussi
Est-ce que c'est plus clair?
