(Resolu) Questions a propos des amplicons

[Fab117]

Bien le bonjour

Alors il y a quelques notions que j'ai pas saisi dans le cours d'UE 11 qu'on a eu a la rentrée:

- A la page 2 lorsque l'on parle d'achondroplasie et de digestion des amplicons grace a des enzymes de restrictions il est marqué:
-> Si G> A (ca veut dire G supérieur à A) : BmfI (ca veut dire quoi ?) ??
-> Si G>C: HpaII ??

- A propos du séquençage il est dit que celui si ce fait sur le brin complémentaire c'est donc bien le brin 5'--> 3' non ? car sur le schéma c'est le brin 3'--> 5' qui est séquencé.

- Le clonage moléculaire et la PCR n'ont rien a voir mais au final elles permettent d'obtenir un grand nombres de molécules d'adn a partir d'un seul double brin. Cependant le clonage permet d'obtenir une grande quantité de copies identiques absolument pure comparé a la PCR ou il peut y avoir des erreurs il me semble. Donc pourquoi n'utilise t'on pas que le clonage moléculaire au final ?

- Quand on parle des genes de selection pour le clonage moléculaire il se trouve au sein du vecteur ou au sein de l'insert ?

Merci beaucoup

[Chob]

Salut !

- Alors le G>A ça veut pas dire que "G est supérieur à A", ça veut dire que le G est remplacé par un A ( Une guanine est remplacée par une Adénosine). Et pareillement, G>C veut dire qu'une Guanine est remplacée par une Cytosine.

Le fait d'avoir ce remplacement d'un nucléotide par un autre, c'est la substitution ( une des mutations de l'ADN ).
Du coup, ta séquence de nucléotides va être modifiée : comme écrit à la fin de la page 2 de la fiche : au lieu d'avoir un codon GGG, tu vas avoir:
soit un codon CGG si le G est remplacé par un C ( G>C)
soit un codon AGG si le G est remplacé par un A ( G>A)

Si ton codon devient CGG, une enzyme, Hpa II ( nom pas à retenir !!!! ) va couper la séquence ! Parce que c'est une enzyme de restriction, donc qui coupe l'ADN double brin au niveau d'une séquence spécifique qu'elle reconnait.
Si ton codon devient AGG, c'est Bmf I qui va pouvoir couper, car elle reconnaîtra la séquence une fois le G remplacé par un A.

Ca veut dire que si tu fais subir une portion d'ADN qui contient la séquence en question à Hpa II :
si il y a coupure de l'ADN -> Hpa II a reconnu sa séquence propre -> il y a eu mutation et la mutation est G>C
si il n'y a pas eu de coupure -> Hpa II n'a pas reconnu sa séquence donc n'a pas coupé

De même avec Bmf I , sauf que la mutation sera G > A


- Pour le séquençage, on le fait dans le sens 5' -> 3'


- Je suis pas sure d'avoir bien compris ta question ..
En gros tu fais la PCR au début, quand tu penses savoir à peu près où se situe le problème au niveau d'un gène : tu peux amplifier un fragments de 150 pb à 3 kb qui entoure la région qui t’intéresse, histoire de l'avoir en grand nombre et pouvoir travailler dessus ++

Le clonage moléculaire, tu le fais quand tu as eu un problème lors du séquençage de ton ADN, notamment quand tu tombes sur un malade qui est hétérozygote : tu veux savoir quelle est la différence entre la séquence de l'allèle sain et la séquence de l'allèle muté, quelles sont les mutations ? ( délétion, addition, substitution .. combien de nucléotides ? etc ). Du coup, pour avoir la comparaison entre les deux séquences, tu fais deux séquençages à part, après avoir séparés les allèles sains des allèles mutés par la technique de clonage.

[Fab117]

Ca répond a toutes mes questions, rien a rajouter Merci beaucoup Chob!!!