[Résoluu] BFM I / HPA II

[Loww]

Bonjour !

J'ai un problème avec la p.12 (en haut) de la ronéo d'UE11 de l'année dernière, et la fiche de la tut' rentrée.

Il est dit que :

- Ronéo : "Avec ces 2 enzymes de restriction, on a une lecture préférentielle permettant de savoir s'il y a mutation et de quel type il s'agit."

- Fiche : "A partir du nombre de fragments, on sait s’il y a mutation ou non mais on ne sait pas laquelle !"



Alors j'aimerais savoir pourquoi on ne pourrait pas savoir laquelle c'est. Parce qu'on ne va pas mettre les enzymes ensemble dans un même bocal, on va les séparer et faire des expériences séparées (ça me semble plus logique). Du coup, on verra bien laquelle coupe, non ? Et de là on en déduit la mutation.


Merci d'avance


[EDIT] : j'ai réexpliqué mon problème (qui a légèrement changé) plus clairement à la fin du post

[Cloud]

Salut,

Chaque enzyme de restriction reconnaît une séquence particulière :

-CTACAG pour BFM I
-CCGG pour HPA II
En rouge figure la mutation liée à l'achondroplasie sur le nucléotide 1138

Lorsque ces enzymes reconnaissent ces séquences, elles coupent l'ADN.
On fait ensuite une électrophorèse pour savoir si l'ADN a été coupé ou non (la séquence d'ADN étudiée dans le cas de l'achondroplasie fait 164 pb) :
-BFM I sépare l'ADN en 2 parties de 109 et 55 pb
-HPA II sépare lui aussi l'ADN en 2 partie de 109 et 55 pb

Lorsque le résultat de l'électrophorèse indique 109 + 55 (cas d'homozygotie de la maladie les 2 brins sont coupés) ou 164 + 109 + 55 (cas d'hétérozygotie 1 brin non coupé et 1 brin coupé), on sait que le patient est atteint mais on ne connaît pas la mutation puisque les 2 enzymes de restriction permettent de séparer l'ADN en 109 et 55 pb.

Par contre, si on utilise BFM I et qu'on a ou pas coupure de l'ADN, on peut dire qu'il y a ou non mutation 1138 G --> A.
Si on utilise HPA II et qu'on a ou pas coupure de l'ADN, on peut dire qu'il y a ou non mutation 1138 G --> C.

Le nombre de fragments (1 ou 2 si homozygote ; 3 si hétérozygote) permet de dire si le patient est atteint de la maladie, mais ne permet pas d'indiquer de quelle mutation il s'agit.
L'utilisation des enzymes de restriction permet de savoir de quelle mutation il s'agit.

J'espère t'avoir aidée

[Loww]

Haha Salut Cloud, ma sauveuse d'UE11

Déjà, merci beaucoup pour ta réponse très détaillée mais je me pose toujours la même question .. (désolée ...^^)


Parce que :

. On fait l'électrophorèse après digestion par les enzyme de restriction non ? (sinon ça sert à rien, on veut justement voir en combien de fragments l'ADN a été coupé)

. Donc, est-ce qu'on met les 2 enzymes "en même temps" ? à ce moment là, OKAY on ne peut pas savoir de quelle mutation il s'agit (1er ou 2nd type) vu que dans tous les cas, on obtiendra plusieurs fragments.

. Mais si on digère séparément, genre on fait un "bac d'ADN digéré par BMH1" et "un bac d'ADN digéré par HPA II", bah on verra bien qui digère et qui digère pas, ce qui fait qu'on peut savoir si c'est la mutation 1 ou 2

Tu vois ce que je veux dire ?

C'est ça que je ne comprends pas .. et en plus comme il y a 2 versions différentes et que je ne vois aucun post ou errata à propos de ce qui a été dit dans la ronéo, ça me met le doute.

En tout cas merci d'avance et merci pour ta réponse d'avant c'est super gentil de m'aider ^^ !

[Cloud]

Salut,

Les deux enzymes sont mises dans le même bac, c'est pour ça qu'on ne peut pas déterminer la mutation en regardant seulement le nombre et la taille des fragments :

- soit on a un seul fragment de 164 pb les 2 allèles n'ont pas été coupés l'individu est homozygote et sain.
- soit on a 2 fragments de 55 pb et 109 pb les 2 allèles ont été coupés l'individu est homozygote et maade.
- soit on a 3 fragments de 55 pb, pb et 164 pb un allèle a été coupé et pas l'autre l'individu est hétérozygote et malade.

Comme les 2 enzymes coupent l'ADN en 2 fragments de 55 et 109 pb, on ne peut pas dire quelle est celle qui l'a coupé.
Si l'une des 2 coupait par exemple l'ADN en 3 fragments ou en 2 fragments de tailles différentes (genre 24 et 140 pb), on pourrait dire "c'est cette enzyme qui a coupé l'ADN, on est donc en présence de telle mutation "

Pour savoir quelle est l'enzyme qui a agit, on peut soit faire 2 bacs contenant chacun une enzyme soit séquencer l'ADN.

C'est mieux ?

[Loww]

Oui c'est vrai ce que tu dis ... mais c'est pas logique pourquoi ils mettent tout ensemble, il y a bien une raison ^^

Parce que sinon je vois pas pourquoi ils sépareraient pas les bacs dès le début, voir si ça coupe ou pas et comme ça on est fixés dès le début, pas besoin de séquençage et tout

Ma foi, en tout cas Merci pour ta réponse !

[Loww]

Je vais tenter d'exposer mon problème plus clairement : Voici la partie du cours qui me pose soucis



. Déjà, pourquoi on fait 2 électrophorèses ? Faire la 2nde directement me paraitrait plus simple car elle permet de dire quelle mutation est mise en jeu ..

. Du coup le séquençage n'est qu'une méthode de vérification.. Et c'est ça le diagnostic de certitude, le séquençage ?

Voilà les 2 grandes questions résumées, je pense que si on les résout tout ira bien

Merci d'avance !

[Cloud]

Salut ,

Je vais te donner mon interprétation :

-La première électrophorèse permet de voir si on a bien amplifié la bonne séquence ADN (celle qu'on cherche à étudier, qui fait 164 pb) on vérifie ainsi l'intégrité de cette séquence avant de la faire digérer par les enzymes de restriction.

-La seconde électrophorèse permet de déterminer :
La présence ou l'absence de maladie
Le type de mutation en cas de maladie (A si BFM I ; C si HPA II)

-Le séquençage permet en effet de vérifier la séquence ADN on pose alors un diagnostic de certitude, c'est-à-dire qu'on est capable d'affirmer, en étant sûr à 100%, que le patient est atteint de la maladie (ou dans le cas contraire qu'il est sain) .

[Loww]

D'accord !

Mais alors la 2ème électrophorèse se fait bien en 2 récipients séparés, avec une enzyme de restriction dans chaque d'après ce que j'ai compris

Dans ce cas là, (désolée j'suis lourde ) je ne comprends pas pourquoi dans la fiche de la tut' rentrée ils font :
1) Une électrophorèse avec tout mélangé (de sorte qu'on ne puisse pas savoir quelle enzyme a coupé qui).
2) Un séquençage pour savoir quelle enzyme a coupé qui.

Et dans le cours on fait si j'ai bien compris :
1) Une électrophorèse avec tout mélangé (de sorte qu'on ne puisse pas savoir quelle enzyme a coupé qui).
2) Electrophorèse en bacs séparés.
3) Séquençage (=diagnostic de certitude)

Parce que pour moi, ce qui me parait le plus logique c'est ta version :
1) Electrophorèse pour vérifier si on a la bonne séquence et s'il n'y a pas eu contamination.
2) Electrophorèse en 2 bacs séparés pour savoir quelle est la mutation.
3) Séquençage pour simple vérification (=diagnostic de certitude).

Enfin, ça y est j'suis perdue
C'est peut-être pas très important tu me diras comme problème mais ça me fait buguer, je peux plus continuer tant que j'ai pas compris ça ^^

Mais je te remercie énormément pour toute la bonne volonté que tu mets à m'expliquer, ça m'aide déjà Beaucoup ! C'est juste les incohérences maintenant qui me posent problème, j'aimerais bien avoir une vraie version claire ..

[Cloud]

C'est vrai que ça fait beaucoup de versions

Je crois que le mieux est d'attendre que notre tutrice vienne tirer tout ça au clair

[Chob]

Saluuuuuut !

C'est beau de voir que vous vous cassez la tête


Effectivement dans la fiche j'ai écrit : " A partir du nombre de fragments, on sait s’il y a mutation ou non mais on ne sait pas laquelle ! " .
Mais c'est vrai que c'est pas très correct .. Enfait je me suis mis en tête qu'on mettais, comme vous dites, les deux enzymes "dans le même bac" , et je ne pense pas qu'en réalité ça se passe comme ça..


Suite à la PCR, on fait une première électrophorèse pour vérifier qu'on a amplifié correctement notre séquence : donc c'est juste une électrophorèse qui permet de vérifier le bon fonctionnement et le bon déroulement de la PCR.
Une fois qu'on sait, grâce à cette première electrophorèse, que notre PCR a bien fonctionné, on va digérer nos amplicons par les deux enzymes.
Et c'est donc là le problème: on fait deux "digestions" séparés ou on met les deux enzymes ensemble ?

Beeen je pense que c'est complètement con de mettre les deux enzymes ensembles .. ( Oui, c'est ce que j'ai bizarement pensé quand j'ai rédigé le diapo et la fiche de la Tut' Rentrée.. allez savoir ! ).

Donc on fait surement ( j'attends quand même le cours de la prof pour en être certaine ) deux digestions séparées :
- d'un coté on fait subir nos amplicons à Bmf
- de l'autre on fait subir nos amplicons à Hpa
Puis on fait notre deuxième électrophorèse, pour voir le nombre de brins apparents
du coup on sait s'il y a mutations; et si oui, laquelle.

Après, pour vérification encore une fois, on va faire le séquençage !

Bon, j'suis désolée pour cette confusion :/
J'attends que les profs fassent leur cours, voir si elles en parleront, mais je pense qu'effectivement on fait deux digestions à part.


J'espère que c'est plus clair pour vous !

[Cloud]

Ok merci Chob d'avoir fait si vite

[Loww]

D'accooooord oui merci beaucoup chob !! Et à toi aussi cloud, ta version était la bonne