clonage

[lea]

salut,

je ne comprend pas bien l interet du clonage ? Ds la roneo , on ns dis que c'est pr séparer les allèles normaux des allèles mutés mais je ne vois pas très bien pq ?

merci

[Chob]

Salut !

Le but du clonage moléculaire c'est d'obtenir en grande quantité (par la multiplication des bactéries) une région d'ADN absolument pure.

En gros , imagine que tu as un patient suspecté d'avoir une maladie génétique. Pour vérifier ton diagnostic, tu vas analyser l'ADN de ton patient : tu vas voir s'il y a des mutations (substitutions, délétions, additions toussa toussa...), au niveau de quel gène, quelle position etc.
Pour ça tu vas séquencer (= connaître la succession des nucléotides) ton ADN (ou plutôt une région d'ADN, parce qu'en général "on sait où regarder").

Le problème avec le séquençage c'est que si ton patient est hétérozygote (donc par définition il aura un allèle sain et un allèle muté), ton séquençage va être illisible au niveau des positions des mutations.
Par exemple : tu veux séquencer une région de 10 nucléotides. Tu commences par le 1er, puis 2° .. jusqu'au 10° pour obtenir le séquençage du brin complémentaire de la séquence complète (j'explique pas le séquençage parce que c'est pas l'intitulé du post, mais si tu ne comprends pas dis le moi).

Et le problème ça va être que tu vas avoir le séquençage de l'allèle muté et de l'allèle sain en même temps.
Donc imagine qu'au niveau des nucléotides 3 et 7 tu aies une substitution : à la fin du séquençage, il va être impossible de dire quelles sont les mutations sur l'allèle muté / quelles sont les différences entre allèle muté et allèle sain parce qu'à ces positions tu auras une superposition de pics de couleur différente (une couleur correspondant au nucléotide complémentaire de l'allèle sain, et une couleur correspondant au nucléotide complémentaire de l'allèle muté).
--> Tu vas avoir un superposition de pics de couleurs identiques au niveau des nucléotides 1,2,4,5,6,8,9 et 10 car il n'y a pas de différences entre l'allèle sain et l'allèle muté (pas de mutations = même nucléotide = même couleur de pic)
--> Tu vas avoir au niveau des nucléotides 3 et 7 un superposition de pics de couleurs différentes, ce qui rend le séquençage illisible en ces positions (mutations = différences de nucléotides entre les 2 allèles = couleurs différentes de pics = illisibilité)

[Ce problème ne se pose pas dans le cas des patients homozygotes malades, car les mutations sont présentes sur les deux allèles : du coup, même séquençage, même couleur de pics en chaque position et séquençage lisible !]

Donc finalement, il te faut obtenir deux séquençages : celui de l'allèle sain et celui de l'allèle muté, pour pouvoir faire une comparaison et voir quelles sont les mutations.
Et donc tu vas faire un clonage moléculaire pour effectivement séparer les 2 allèles, càd obtenir des régions d'ADN absolument pures.

[Léa *]

Coucou, je viens m'incruster ici car j'ai un petit peu de pb sur la compréhension du clonage.
En gros à la fin de ton message Chob, tu dis qu'on va obtenir des régions d'ADN absolument pures (je suis d'accord, c'est le but du clonage^^) mais est-ce qu'on va ensuite comparer notre allèle muté avec la région d'ADN pure qu'on a obtenu ET notre allèle sain avec la région d'ADN pure qu'on a obtenu?

Pour moi ca serait logique mais si c'est pas ça c'est que j'ai vraiment rien compris

Ps: je veux bien une petite explication sur le séquençage histoire d'être sur d'avoir bien compris et de pas être passé à côté

[Chob]

Salut !

Enfait quand on dit qu'on obtient des séquences "pures" ça veut dire qu'on obtient séparément l'allèle muté et l'allèle sain : donc tu vas avoir d'un coté uniquement les séquences mutées, et de l'autre uniquement les séquences saines.

En gros, sur ta boite d'agar, tu vas obtenir plein de "rond blanc" qui sont des clones bactériens (rappel du collège/lycée quand on mettait une solution de bactérie sur une boite d'agar, tu laissais la boite quelques jours le temps que les bactéries se multiplient et au cours d'après tu voyais ces "ronds blancs").
Toi sur ta boîte d'agar, tu as étalé deux solutions différentes :
l'une contient les bactéries ayant intégrées l'ADNrecombinant avec l'allèle sain
l'autre contient les bactéries ayant intégrées l'ADN recombinant avec l'allèle muté

Or il faut se rapeller que les bactéries se multiplient de manière strictement identique : les "bactéries filles" issues d'une "bactérie mère" lui seront exactement identiques. C'est pour ça qu'après quelques jours (temps de multiplication des bactéries) on obtient ce qu'on appelle des clones = "tas" de bactéries strictement identiques entre elles.

Donc il faut que tu imagines que même si tu as étalé tes deux solutions sur ta boite d'agar avec des bactéries différentes (elles n'ont pas le même ADNrecombinant, donc pas le même insert càd pas le même allèle), ces bactéries ne vont pas se "mélanger entre-elles" : chaque clone va correspondre à un des deux types de bactéries.

Tu vas alors récupérer les clones, puis tu vas récupérer pour chacun leur ADNrecombinant, ou plus précisement leur insert (insert = allèle, muté ou sain) que tu vas ensuite séquencer.
C'est comme ça que tu vas pouvoir obtenir deux séquençages séparement, l'un de l'allèle muté et l'autre de l'allèle sain, pour pouvoir faire une comparaison et connaitre les différences / les mutations qui sont apparues et qui provoque la maladie en question.


Sachant que vous avez le cours mardi, je préfère que tu assistes au cours et que tu essaies de comprendre avec l'explication de la prof avant de me lancer, parce que par écrit c'est vraiment pas facile et ça va être super long

[Léa *]

Merci pour cette explication, c'est bien clair maintenant! Oui je verrai en cours sinon je reposerai ma question sur le forum