Carte de restriction Ronéo2

[Fab117]

Bonjour!!



Alors a propos de cette diapo il y a une chose que je comprend pas :
- Pour le pour le plasmide avec insert comment cela se fait t'il qu'on est 2 fragments sachant que le plasmide a incorporé l'insert ?

Je suis d'accord sur le nombre de paire de base total qui est égale à 948 + 2513 pb mais pourquoi on a 2 fragments .

Les 2 fragments de 2513 et 948 pb me font plutot penser que notre insert c'est fixé au fragment de 448 mais ne s'est pas intégré au final.
Ce que je veux dire c'est que je vois pas en quoi cette méthode prouve que notre plasmide a incorporé l'insert sachant que sur l'électrophorèse son nombre de paire de bases est le même. ( Pour A comme pour B, notre plasmide a la meme taille)

A la base j'avais bien compris cette éxo à la tut rentrée je pensée que quand on disais 2513+948 c'etait pour nous montré le total , mais j'avais pas vu que sur un gel on avait 2 fragments bien distincts.

Du coup je comprend plus rien

Merci !!

[Kardajian]

Salut !

On a 2 possibilités :

Plasmide sans Insert : Tu utilises l'enzyme de restriction Pvu II par exemple, tu vas avoir deux fragments, un de 448 pb et l'autre de 2513 pb (sauf erreur de calcul pck il est tard xD) donc la y a pas de problème apparemment

Plasmide avec insert : ton plasmide va intégrer l'insert, il va se placer entre les deux zones que l'enzyme Pvu II va couper. Du coup, lorsque tu vas utiliser l'enzyme de restriction, vu qu'il y a toujours ses deux sites, il va couper aux deux endroits. Tu as donc toujours deux fragments, mais la différence est que tu vas en avoir un qui à intégrer l'insert de 500 pb, et qui sera plus grand.
Ici, c'est le fragment de 448 pb qui l'a intégré, du coup cette fois ci il fait 948 pb et tu as toujours de l'autre coté ton fragment de 2513 pb

Au final tu vois sur le gel qu'une tâche est à la même hauteur pour le patient A et B mais l'autre tâche n'est pas à la même hauteur.

La tâche du patient B est plus haut, donc son deuxième fragment est plus grand que celui du patient A, tu en déduis qu'il a intégré l'insert

[Chob]

Salut !

Que le plasmide est intégré l'insert ou non, l'enzyme utilisée coupe toujours aux mêmes endroits, et bien de part et d'autre du site où l'insert va potentiellement être introduit.

Dans tous les cas, tu obtiens bien 2 fragments car l'enzyme utilisée coupe 2 fois : prends un cerceau / un chouchou / un donut / un truc circulaire, tu le coupes en 2 endroits -> ton cerceau / chouchou / donut / truc rond va bien être coupé en 2.

Si on prend une enzyme qui coupe de part et d'autre du site d'insertion de l'insert, ça veut dire que si l'insert est introduit il va être intégralement dans un des 2 fragments !

Et du coup en calculant la taille des fragments obtenus :
- si il n'y a pas d'insert tu connais la taille que doivent faire tes 2 fragments (car tu connais la taille de ton vecteur et les 2 sites de coupures de ton enzyme !)
- si tu as l'insert introduit au sein de ton vecteur, tu vas bien voir (par migration electrophorétique) que tu vas obtenir un des 2 fragments plus lourd car ce sera celui qui contient l'insert !

Jvais essayer de tourner l'exercice autrement.

Par exemple : tu as un vecteur qui mesure 1000pb et tu as une enzyme qui coupe en 0 (à midi sur une horloge) et en 250 (à 3h sur une horloge)
Et ton but était d'intégrer au sein de ce vecteur un insert de 100pb
- si à l'électrophorèse tu obtiens 2 fragments : un fragment de 250 et un fragment de 750 , ça veut dire que l'insert n'a pas été introduit !

- si à l'electrophorèse tu obtiens 2 fragments : un fragment de 350 et un fragment de 750, ça veut dire que tu as eu une insertion de 100pb au sein du fragment qui normalement aurait du faire 250pb ! L'insert s'est introduit entre le midi et le 3h sur l'horloge !
Et c'est par migration électrophorétique, en se répérant aux MPM, que tu vas voir que l'un des 2 fragments est + lourd que normalement (donc migre moins loin !! ) et tu vas donc déduire que l'insert souhaité a bien été introduit

[Fab117]

Vos explications sont top et j'ai bien compris le principe de savoir ou non si le vecteur est inséré.

Mais mon probleme vient a ce niveau la :

si à l'electrophorèse tu obtiens 2 fragments : un fragment de 350 et un fragment de 750, ça veut dire que tu as eu une insertion de 100pb au sein du fragment qui normalement aurait du faire 250pb ! L'insert s'est introduit entre le midi et le 3h sur l'horloge !

Donc le fragment de 350 Pb veut dire que notre insert de 100 Pb c'est associé a notre fragment de 250 Pb.
Mais et c'est la que je comprend pas, en quoi le fait que l'insert ce soit associé au fragment prouve qu'il c'est intégré au plasmide.
Car si notre insert était totalement intégré au plasmide, on ne devrait avoir qu'un seul fragment qui correspond au plasmide ayant intégré notre insert

Vous voyez mon problème ^^ ?

[Kardajian]

En fait, d'un coté tu prends un plasmide qui n'a pas intégré l'insert, et tu le coupes en deux avec l'enzyme de restriction, tu vas alors avoir deux morceaux

De l'autre, tu fais en sorte que ton plasmide intègre l'insert et ensuite tu le coupes en deux, tu vas encore avoir deux fragments, mais cette fois ci, l'un des deux fragments va être plus grand que lorsqu'il n'avait rien intégré (pck on évite de couper en plein de l'insert^^) ce qui prouve que l'insert à été intégré

Donc à la base si tu veux tu n'as qu'un fragment (plasmide + insert) puis tu le coupes en deux (fragment 1 + (fragment 2 avec insert)) et tu fais tes conclusions ^^

Après si tu te demandes pourquoi on ne fait pas direct migrer les deux plasmides (celui qui a intégré et celui qui est "vide") pour voir lequel a bien l'insert, je suppose qu'ils ne doivent pas migrer correctement avec leur forme circulaire, mais honnêtement je sais pas,vaut mieux attendre une réponse de Chob

Bonne journée à vous deux !

[Fab117]

Merci Karda je viens de capter le truc en fait j'avais pas compris qu'on recoupé après que l'insert ce soit intégré ^^

Dernier truc, en fait notre insert va s'insérer de cette manière la au final c'est ça : (Mon dessin est dégeulasse)



J'ai pas l'air con avec mes dessins

[Kardajian]

haha Yep je dirai que ça fait ça ^^

je fais un ptit dessin aussi par solidarité allez

Bonne soirée

[Chob]

Ton dessin ne va pas Fab : l'insert est au sein du fragment coupé (l'enzyme coupe de part et d'autre du site où va être inséré l'insert)
Le dessin de Kardajian est juste !!

[Fab117]

Oula ça m'embrouille , si notre insert s'insert dans notre fragment et que notre fragment est produit grace a une enzyme qui a coupé a ses extrémités, ca veut dire qu'on utilise 2 enzyme, une pour couper aux extrémité du fragment et une pour que notre insert s'insert dans le fragment c'est ça

[Chob]

Enfait je pense que tu t'embrouilles dans l'ordre chronologique des choses ^^

D'abord, tu formes ton ADN recombinant : tu utilises une enzyme de restriction (E1) qui va couper ton vecteur et ton plasmide (bouts cohésifs / bouts francs / les 2) puis une ligase va lier les deux
ton insert est inséré dans ton vecteur = ADN recombinant

Et plus tard, pour vérifier que l'insert est bien présent dans ton vecteur (rappel : les vecteurs peuvent se refermer sur eux-même sans avoir inséré l'insert, et ne sont donc d'aucune utilité), tu vas faire subir ton ADN recombinant (vecteur + insert) à une enzyme de restriction (E2) qui va couper de manière à obtenir 2 fragment, dont l'un portera intégralement l'insert si le vecteur l'a bien intégré.
Donc E2 coupe et tu dois obtenir 2 fragments.
Et pour savoir le vecteur a bien intégré l'insert (ce qui reviens à savoir si l'insert est présent au sein d'un des deux fragments obtenus après coupure par E2) tu vas faire une migration électrophorétique :
selon la taille des fragments, ils migregront + ou - moins
en comparant avec la migration des fragments obtenus par coupure du vecteur sans insert par la même enzyme E2, tu vas pouvoir savoir si l'insert a été intégré : si un des fragments migre moins loin, c'est qu'il est + lourd et donc que l'insert est présent.