Concernant le séquençage une seule amorce est nécessaire puisqu'il s'agit d'une synthèse d'un brin complémentaire d'ADN avec incorporation au hasard de dNTP et ddNTP, les ddNTP bloquant la synthèse. Cependant pour avoir des résultats fiables on réalise toujours la recherche d'une mutation en effectuant la séquence sur les 2 brins donc dans 2 tubes séparés contenant chaque une amorce différente (sens ou revers). C'est ce qui est schématisé sur la diapo 67
il s'agit de 2 réactions de séquence. Ces amorces peuvent correspondre aux séquences d'amont et d'aval utilisées pour la PCR.
En résumé :
- pour la PCR il faut dans un tube:
ADN du patient + 2 amorces (sens ET revers) + dNTP + Taq Polymérase et son tampon contenant du MgCL2-pour le séquençage il faut
pour un tube: produit PCR + 1 amorce (sens) + dNTP + ddNTP + ADN Polymérase et son tampon contenant du MgCL2 dans un autre tube: produit PCR + 1 amorce (revers) + dNTP + ddNTP + ADN Polymérase et son tampon contenant du MgCL2Concernant le QCM7 du CCB 2011 - 2012: la bonne réponse est la réponse B:
La question étant de déterminer le génotype des différents membres de la famille (présence de la mutation ou absence de la mutation): par digestion BfmI vous détecterez les patients non porteurs de la mutation alors qu'avec HpaII vous détecterez les patients porteurs.
Sur la diapo 32 les dNTP et les ddNTP sont en couleur mais uniquement les ddNTP sont marqués avec un fluorochrome. Effectivement le fait que tout soit en couleur peut prêter à confusion.
Différence migration électrophorétique - capillaires:
La migration électrophorétique sur gel d'agarose permet de séparer des fragments d'ADN en fonction de leur taille. Les fragments migrent dans un champ électrique à travers un gel d'agarose placé dans un support.
La migration en capillaire est exactement la même chose à la différence qu'elle est réalisée dans un capillaire (ce qui remplace le support de gel d'agarose) dans un champs électrique à travers un polymère (qui remplace le gel d'agarose).
J'espère que ça vous convient
