Différence PCR / clonage

[arth]

Salut,

Chez la famille B :
Le père est hétérozygote.
La mère est également hétérozygote et on sait qu'il s'agit d'une mutation qui induit une erreur d'épissage.

Ma question est la suivante. Une fois qu'on a transformé notre ARNm en ADN, pourquoi on ne fait pas directement une PCR suivi d'un séquençage pour voir les nucléotides qui ont été ajoutés ? Parce que là dans le cours, on fait un séquençage et je ne comprends pas trop l'utilité. En faite, je ne comprends pas ce qu'on cherche à séparer et pourquoi.

Merci d'avance...

[Robisome]

Coucou

Si j'ai bien compris la question, tu veux savoir l'utilité de l'étape de clonage.

C'est simple : comme tu dis, la mère est hétérozygote - quand on fait l'analyse d'un gène, on se retrouve avec les deux allèles indistinctement -
or, si on a des fragments différents, ils se chevauchent et on arrive plus à lire les nucléotides...

ils se chevauchent à partir du moment où l'allèle muté présente les nucléotides en plus et puis c'est fini, tout est décalé.. aie confusion

Alors les généticiens ont trouvé un système pour séparer les fragments d'ADN muté des fragments non mutés - comment ? via le clonage moléculaire !

une fois séparés, on peut reprendre les étapes d'analyse habituelles et on pourra bien lire la mutation

Dis-moi si j'ai répondu à ta question, ou si tu veux que je reprenne d'autres parties aussi! Comprendre c'est fondamental

[arth]

Salut,

Alors déjà merci pour ta réponse.

Du coup, j'ai d'autres petites questions.

1. Si je comprends bien, chez la famille A, on peut identifier directement la mutation du père et de la mère, car c'est juste la substitution d'un seul nucléotide. Alors que chez la famille B, c'est plus chiant car il y chevauchement des couleurs (nucléotides) par le séquençage.

2. Question sur le déroulement du clonage :
Première étape : on met notre insert dans le plasmide. Mais c'est quoi cet insert ? Je suppose qu'il y en a deux vu qu'on cherche à les séparer.
Deuxième étape : on introduit les ADN recombinants dans les bactéries
Troisième étape : on sélectionne les bactéries ayant intégré le plasmide
Quatrième étape : on sélectionne les bactéries ayant intégré l'insert Mais là on peut avoir deux types d'insert non ? C'est après cette étape qu'on va séparer nos différents inserts ?

J'espère que mes questions ne sont pas trop floues parce que j'ai un peu de mal à expliquer ce qui me pose problème.

[Robisome]

Re-coucou

1. oui, parce que ce n'est pas une substitution simple de nucléotides qu'on voit dans le cas de la famille B, mais cette substitution dans un intron provoque le rajout d'une séquence de nucléotides sur l'ARNm, voilà

2. oui, l'insert c'est nos fragments d'ADN qu'on a besoin de séparer et de pouvoir bien lire en séquençage.
il y en a bien deux: un muté, un sauvage. On les insère aléatoirement dans des vecteurs qu'on va insérer dans nos bactéries.
Ce seront ces bactéries qui vont proliférer en colonies et nous on sait qu'elles se mélangent pas, donc une colonie dérive d'une seule bactérie.
Ce qui veut dire qu'elles auront toutes le meme ADN recombinant --> qu'on peut bien prélever et séquencer.

mais avant tout ça oui, il faut bien sélectionner les bactéries qui ont ingéré le plasmide - via les antibiotiques
et parmi celles-ci, il faut sélectionner celles qui ont bien ingéré un plasmide avec l'insert - via la sélection blanc/bleu
Ces étapes sont nécessaires pour s'assurer que la méthode ait bien marché.

Parmi les bactéries qui ont réussi ces étapes, on retrouve des colonies qui se sont elles-memes séparées en "poussant". En fait elles ont fait tout le job de séparation, le généticien n'a qu'à prendre ces colonies et les séquencer. Il va trouver dans une l'ADN muté et dans l'autre l'ADN sauvage.

Dis-moi si j'ai été assez claire

[arth]

Vraiment merci beaucoup !

J'ai mis du temps à comprendre mais maintenant c'est tout de suite beaucoup plus clair.
Encore merci pour les explications