Récap NGS

[mm]

Bonjour
Pourrais-tu me confirmer ce récap ? Je te remercie
PS mon récap n'est ni exhaustif ni dans le bon ordre, c'est juste pour visualiser quelques éléments du cours

Commun à Illumina et Thermofischer
sphères magnétiques
sondes de capture s'apparient avec le fragment d'adn du patient # primers s'apparient avec les adaptateurs
on connait la séquence nucléotidique du primer (dépend du fragment d'adn), de l'adaptateur (identique pour tous les fragments), du barre code
préparation de l'échantillon (=1/ fragmentation 2/ adaptateurs+BC 3/biotine+streptavidine 4/sondes de capture)
milieu réactionnel (DNTP, Polymérase, tampon, primers (primers d'adn ou d'arn ici?), des fragments d'adn)
PAS DE DDNTP, seulement des DNTP
ordre : adaptateur - barre code - fragment d'adn - barre code - adaptateur

Ne concerne que Thermofischer
sphères métalliques
microréacteurs
ADN Polymérase
fragment d'adn copié jusqu'a ce qu'il recouvre entièrement la sphère
au départ on a que 2 primers sur la sphère puis à la fin on a 2n primers (n=nombre de fragments d'adn)
PCR clonale = L’ordre des réactions est : dénaturation par la chaleur, hybridation de l’amorce P1, élongation, dénaturation, hybridation
de l’amorce A, élongation, dénaturation, hybridation du brin synthétisé sur le primer de la sphère, élongation
succesion de NT 500/run de séquençage pourtant on n'a des fragments de 200-400pb (donc une succesion de 200à400 NT). Est-ce parce qu'avec la somme (adaptat+BC+Frad) on arrive à 500?
A l’étape des microréacteurs, l’ADN a déjà été rendu auparavant simple brin ++

Ne concerne que Illumina
Taq Polymérase
une fois le fragment copié, on enlève le brin sens (on le conserve), on garde le brin reverse pour répéter le cycle Dénaturation-Hybridation-Elongation
on n'élimine ensuite les brins réverses, on ne séquence que les brins sens
flow cell = support physique de la lame de verre ou l'ensemble des clusters?

[Généthilde]

Salut, je suis désolée de répondre si tard ...

Il y a quelques points à revoir dans ton récap !
Pour ce qui est des étapes communes, dans la préparation des fragments il n'y a pas de DNTP puisqu'il n'y a pas d'amplification
Attention à l'ordre : Adaptateur P1, ADN du patient, BC, Adaptateur A
De plus tu oublies de mentionner toute l'étape d'analyse informatique qui est très importante ( elle peut utiliser des outils un peu différents en fonction des plateformes mais ce n'est pas précisé dans le cours )

Pour Thermofisher :
Il ne faut pas que tu comptes les primers sur la sphère dans le sens où au début il n'y en a pas que 2, la sphère est recouverte de primers qui sont identiques
Il ne faut pas compter les NT pour savoir si il y en a 500 ou pas c'est juste l'étape que l'on va répéter environ 500 pour incorporer tous les nucléotides et avoir des séquences qui vont être lisibles en analyse informatique

Pour Illumina :
Attention !! Au tout début on enlève le brin qui est venu se fixer sur la lame et à la fin en enlève tous les brins reverse pour ne conserver que les brins sens
La lame de verre correspond à la flow cell ( on peut dire les deux donc aucun piège là-dessus )

Voilà pour ton récap, si tu as des questions surtout n'hésites pas !!

[mm]

Un grand merci Mathilde !