technique Klenow

[BABE]

Salut Encore moi ... désolée mais j'ai beaucoup de questions :/

Lors de la technique Klenow, on utilise une polymérase qui va agir au niveau de l'extrémité 5' de l'insert.
Mais pourquoi utilise t-on une phosphatase sur le vecteur ?

Merci

[Lady Vic]

Coucou Babe

Quand on a un vecteur avec des bords francs et un insert avec des bords cohésifs ne permettant donc pas la création de liaisons, on a au choix 2 méthodes pour traiter l'INSERT :
- technique de la nucléase S1
- technique de Klenow

Et en fait la technique de Klenow consiste à utiliser une polymérase qui va synthétiser en présence de dNTP le complémentaire des extrémités simples brins sortants 5' de l'INSERT : on obtient ainsi un insert à bords francs en comblant les extrémités sortantes.

La phosphatase, on l'utilise quand on choisit la méthode utilisant une même enzyme à extrémités franches pour l'insert et le vecteur. Pourquoi ? Parce que le vecteur linéarisé va pouvoir se refermer sur lui-même sans avoir intégré l'insert. Les groupements phosphates deviennent des groupements OH et la ligase ne pourra plus former de liaisons phosphodiesters entre les 2 extrémités du vecteur. Par contre, la phosphatase n'agit pas sur les groupements phosphate de l'insert et donc en présence d'ATP, la T4 DNA ligase va pouvoir former 2 liaisons phosphodiester entre le vecteur et l'insert.


Voili, voilou, j'espère que c'est plus clair

Bon courage

[BABE]

Merci Lady Vic !