Chromatographie par échangeur d'ions

[epsilon59]

Bonjour en regardant la diapo numéro 87 du cours sur les protéines je ne comprends pas bien comment marche l'expérience "chromatographie par échangeur d'ions" ni a quoi elle aboutit. Si quelqu'un pouvait m'expliquer comment ça marche et pourquoi on fait cette expérience ?

Merci d'avance

[Captain Shepard]

Il me semble que toutes les techniques d'analyses des protéines seront l'objet du prochain cours Epsilon, je n'ai pas le souvenir de GuiGui qui en parle en cours

[camilleM]

L'année dernière Guidi ne l'a pas fait mais apparemment il va en parler au prochain cours et c'était au programme des années précédentes.

Alors je vais essayer de m'y coller mais c'est juste une réponse provisoire et ce sera a confirmer/infirmer par un tuteur!

Le but c'est de déterminer la composition d'une protéine (donc d'étudier les AA qui la compose).

* Pour une chromatographie sur colonne échangeuse de cation, on a une résine qui est constituée de billes chargées négativement (donc vont accrocher les AA chargés positivement):

- d'abord on fait subir à la protéine une hydrolyse acide afin d'obtenir des AA libres

- on applique une solution de pH croissant (on augmente progressivement le pH) sur la colonne:

Donc on commence avec un pH faible, puis on l'augmente progressivement ce qui va modifier les charges des AA (quand le pH atteindra le pKa d'une des fonctions ionisables de l'AA):
Quand l'AA est chargé postivement, il est accroché à la résine
Quand l'AA atteint une charge nulle (donc par augmentation de pH), il va se décrocher de la colonne

Du coup en augmentant progressivement le pH, on va décrocher successivement tous les AA puisqu'à la base on a le groupement aminé qui est sous forme ionisée (donc chargé +) => l'AA est donc accroché a la colonne. Puis en augmentant le pH on va finir par dépasser le pKa d'un groupement ionisable de la chaine latérale ou du groupement carboxylique, du coup il portera une charge - => on aura une charge globale nulle ce qui va permettre de décrocher l'AA de la colonne

- après ces AA sont quantifiés par spectrophotométrie et donnent un pic d'absorption (lié à sa concentration)

- on observe en suite les résultats sur un chromatogramme:

les AA élués en 1er sont donc ceux aux pHi les plus faibles et les derniers sont ceux au pHi les plus forts.


*Pour une chromatographie sur colonne échangeuse d'anion c'est le même principe sauf qu'on applique à la colonne une solution de pH décroissant et qu'on a des billes chargées + (donc c'est les AA chargés - qui seront accrochés)

Voilà je sais pas si c'était clair, mais c'est un peu compliqué à expliquer (et à comprendre haha) mais j'espère t'avoir quand même un peu éclairé

[camilleM]

Ceci dit les QCMs que j'ai fait sur ça ne nécessitaient pas vraiment de comprendre cette technique, en général on nous donne juste les pKa des groupements ionisables de différents AA (donc on calcule les pHi), on te dit qu'on applique une solution de pH croissant ou décroissant (donc on doit en déduire le type de colonne: soit échangeuse d'anion soit de cation) et on nous demande lesquels sont élués en premiers/derniers

[epsilon59]

D'accord je comprends mieux Merci beaucoup !

[camilleM]

Pas de soucis
mais il faudrait quand même qu'un tuteur y jette un œil et modifie ce qu'il y a a modifier

[daphné]

bonsoir!
effectivement j'ai vu le pr. Giudicelli aujourd'hui et il m'a dit qu'il commencerait le cours de demain par les méthodes d'études des protéines, donc tu verras tout ça en détail à ce moment là
en attendant sur le principe la réponse de camilleM est bonne (merci au passage!)

[epsilon59]

Merci à vous deux
Mais j'ai toujours un problème qui persiste...quelle est l'utilité du NaCl? D'après ce que je comprends lorsque le gel est chargé positivement les protéines ayant une charge - vont s'y fixer et si on ajoute le NaCl le Cl- va décrocher les protéines qui y sont collées. Ainsi plus on est obligés d'augmenter la concentration en NaCl plus il y avait de protéines chargées négativement. C'est bien ça? ou est ce que je me trompe complètement?

Merci

[Kick-Ass]

Salut ! Pour comprendre l'utilité du NaCl je vais t'expliquer ma vision du principe général:

Si on part du principe que tu es dans une colonne contenant des billes entourées de résines leur conférant une charge négative: Les protéines ou AA (si tu les a hydrolysés au préalable) vont être séparés en fonction de leur charge. Des prots avec une charge globale négative ne vont pas se lier avec les billes chargées et donc tomber en premier, alors que les prot positives se lieront avec les billes négatives de manière plus ou moins forte suivant leur quantité de charge positive.

Maintenant comment décrocher les protéines positives des billes chargées négatives ? Et bien en utilisant un gradient de NaCl. En effet quand tu balance du Na+ Cl- le Na+ va entrer en competition avec les proteines chargées + liées sur les billes négatives. Celles qui possèdent peu de charge + vont se libérer assez facilement (peu de NaCl nécessaire), le Na+ prend la place de la prot chargée + sur la bille et la prot libérée se lie au Cl- pour enfin sortir de ce tube. Une protéine très fortement positive nécessitera un fort apport de Na+ pour entrer en compétition et ainsi être libérée. Donc les + positives seront libérées en dernier !

[epsilon59]

Merci beaucoup tout est clair maintenant !

Bonne journée