Ronéo 2 page 5 déphosphorylation

[MarionL.]

Hello
C'est un détail mais je ne comprends pas trop pourquoi on peut aussi dephosphoryler l'insert (je pensais que c'était que pour le vecteur) et avoir majoritairement la liaison vecteur/insert, car si on déphosphoryle l'insert le vecteur pourra toujours se refermer sans l'insert non ??
Merci d'avance et bonne journée

[Avendil]

Je suis d'accord, ça paraît pas trop logique ^^

[Parendar]

Salut,je ne comprends pas pourquoi déphosphorylé le vecteur permettrait de privilégier la liaison insert-vecteur,car si on gène la liaison vecteur-vecteur on gène également la liaison vecteur-insert :/

[MarionL.]

Hello parendar
Si tu dephosphoryles les bouts du vecteur (tu auras des OH) du coup la liaison avec l'insert sera favorisée puisque les deux bouts du vecteur ne pourront plus s'associer (l'insert est le seul a être phosphorylé) ! Va voir le schéma en cas, c'est plus explicite !!
Bonne soirée

[Parendar]

Hello parendar
Si tu dephosphoryles les bouts du vecteur (tu auras des OH) du coup la liaison avec l'insert sera favorisée puisque les deux bouts du vecteur ne pourront plus s'associer (l'insert est le seul a être phosphorylé) ! Va voir le schéma en cas, c'est plus explicite !!
Bonne soirée

Salut,je vois ce que tu veux dire, même si c'est plus difficile de lié le vecteur et l'insert après déphosphorylation,ça reste plus simple que de lié le vecteur avec lui même.
Je te remercie

[Chloette]

+ 1 pour suivre

[Azula]

Hey

Alors je pense que ce sera plus claire avec ces diapos :

En fait, vous voyez que sans l'étape de déphosphorylation vous avez 2 possibilités pour la ligase :
refermer le vecteur sur lui-même
refermer le vecteur avec l'insert
Disons que la réaction de fermeture du vecteur sur lui-même est plus favorable, du coup au final on se casse la tête à placer des inserts dans des vecteurs pour séparer 2 produit PCR ect mais on se retrouve avec une majorité de vecteurs "vides" .

Solution : Déphosphorylation des extrémités 5' du vecteur, comme ça on rend impossible cette "auto-fermeture" des vecteurs. On ne donne plus le choix à la ligase entre refermer le vecteur avec ou sans insert mais seulement avec insert.

Problème : on a jamais réellement 100% d'insertion de l'insert malgrés l'étape de déphosphorylation du veteur.
D'où la séléction blanc bleue ect

Voilà j'espère que ça vous éclaire, si vous avez d'autres questions n'hésitez pas.
Bonne journée

[MarionL.]

Merci pour ton expliquation mais personnellement j'avais bien compris cette partie
Ma question était justement par rapport au fait qu'on nous dit qu'on peut aussi bien dephosphoryler l'insert que le vecteur mais je ne vois pas l'intérêt de dephosphoryler l'insert ...

[Azula]

Aaaah effectivement je suis à côté ^^

Oui c'est pas vraiment faux car en soit on peut déphosphoryler l'insert et le vecteur les 2 ont des extrémités 5'P.
Mais déphosphoryler l'insert n'a pas d'interêt comme tu dis car il ne risque pas de "se refermer " sur lui-même.
Et comme le montrent les diapos que je vous ai jointes au-dessus, c'est bien le vecteur qu'on déphosphoryle.

Un 1/2 errata ? je crois bien ...

Je réponds à ta question ?

La bise

[MarionL.]

Oui alors on est d'accord
Merci pour ta réponse et bonne soirée !!