Sequençage des mutations du syndrome de Wolfram

[Bro-06]

Plop

J'ai du mal à saisir pourquoi on travaille sur l'ARN pour détecter des mutation introniques,
Je comprends comment c'est possible etc, mais je comprends pas pourquoi ! Quand on travaille sur les mutations exoniques, on travaille sur des fragments pas epissés, donc sur un ADN où il y a déjà les introns, donc pourquoi on détecte pas les mutations introniques ?

[Gollume]

Hello

Alors je vais essayer de t'expliquer. Je te refais mon mea culpa ici aux yeux de tout le monde et j'avoue avoir été une marraine/tutrice indigne cette dernière semaine.

La PCR classique te permet d'amplifier les régions EXONIQUES d'une séquence d'ADN. (Ca c'est la définition basique)
l'ADN tu sais que c'est un enchainement de régions INTRON-EXON à la suite.

Ce qui veut dire que lors d'une PCR classique, tu vas amplifier les exons sans prendre en compte les introns.
De ce fait tu ne pourras détecter les mutations de cette portion d'ADN seulement si elles se situent au niveau d'un exon.C'est bon ca?

Le problème c'est que des fois t'en détecte pas et c'est pas normal.

Prenons l'exemple du syndrome de Wolfram:

- c'est une pathologie RECESSSIVE
- il faut que l'individu possède les deux versions du gènes MUTEES pour être malade
- un enfant malade est issu forcément de parents au moins PORTEURS de la mutations (c'est a dire hétérozygote pour la mutations)

Pour le coup, tu vas prendre l'ADN de l'enfant, et dans le syndrome de wolfram le gène WFS1.
Un gène c'est 2 allèles : un du père, un de la mère. Tu vas chercher à connaître la séquence nucléotidique mutée au niveau des allèles.
En bon professionnel, tu vas réaliser une PCR classique de l'ADN de l'enfant.
Le problème est que à la suite de cette PCR tu ne trouve qu'une seule mutation EXONIQUE (forcément t'as fait une PCR à partir de l'ADN de l'enfant et que c'est la définition de la PCR)

Donc à la suite de cette PCR tu te dis que l'enfant est hétérozygote pour la mutation.
Le problème c'est que c'est pas possible puisque l'enfant est malade et que le syndrome de wolfram est une pathologie récessive.

Forcément la mutation que tu n'as pas détecté à la suite de ta PCR sur un des allèle du gène WFS1 de l'enfant est sur un INTRON.
Sauf que voilà tu ne peux pas amplifier les INTRONS avec une PCR classique donc tu peux pas la trouver.

Donc tu vas chercher à voir s'il y'a une mutation au niveau intronique.
Dans ce cas, au lieu d'amplifier directement l'ADN de l'enfant, tu vas laisser se dérouler la transcription. On passe de l'ADN à l'ARNm.

Au cours de la maturation du transcrit primaire, comme tu l'as vu au premier semestre en biomol, il y'a ce qui s'appelle l'EPISSAGE.
L'épissage permet de supprimer les introns.
Sauf qu'on peut retrouver au cours de cette maturation des mutations au niveau intronique qui vont modifier l'épissage classique.

Ici dans le syndrome de Wolfram:

" Sur une partie intronique du gène WFS1 chez la mère, on a changement d’un G en A formant un AG (site accepteur d’épissage) -> création d’un site cryptique d’épissage "

Et en fait ce qu'il se passe c'est que cette partie intronique va devenir exonique. C'est a dire qu'il y'a un morceau de cet intron qui ne va pas être supprimer.

Au final l'ARNm (séquence codante qui correspond à une succession d'exons transcrits) sera plus long que l'enchainement des exons au niveau de l'ADN initial mis bout à bout .
Est ce que tu vois ce que je veux dire?

Voilà ca y'est tu as un ARNm dans lequel est caché une mutation que tu n'as pas détecté par PCR classique lorsque tu étais encore au niveau de l'ADN.

Le problème c'est que tu ne peux pas amplifier directement ton ARNm directement par PCR. Il faudrait retourner à de l'ADN pour pouvoir amplifier les séquences codantes c'est a dire les exons...

Et bien c'est là qu'intervient la REVERSE TRANSCRIPTASE: à partir de la séquence codante de l'ARNm qu'on a obtenu elle va donner une séquence ADN qui est appelée ADN complémentaire (ADNc)
Cet ADN complémentaire a la même tête qu'un ADN initial, sauf qu'un des exons de l'ADN complémentaire sera plus long que le même exon de l'ADN initial.
En effet le bout d'intron qui s'est transformé en bout de séquence codante, correspond maintenant à un exon au niveau de l'ADNc.

Au final t'as obtenu une séquence d'ADN qui contient la mutation intronique.
Là tu peux utiliser la PCR classique et t'amplifie alors les exons de l'ADNc pour pouvoir déterminer la séquence nucléotidique du morceau d'exon en plus qui correspond en fait à un morceau d'intron à la base.

Donc au final tu travaille à partir d'un ARN pour revenir à un ADN.

Est ce que ca va ? j'ai essayé d'être la plus claire possible mais j'avoue ca peut être un peu flou des fois ... n'hésite pas si t'as pas compris

Bisous loulou plein de courage !
Bonne fin de journée

[Bro-06]

Oui d'accord mais pourquoi la PCR ne se fait pas sur les séquences introniques? Du moment où on ajoute un primer au début et à la fin, la Taq Polymerase elle transcrit entre, osef que ce soit des introns ou pas non ? Et ensuite séquençage et on voit autant les mutations introns que exons, c'est ce qui me semble logique en tout cas

[Gollume]

Alors effectivement tu transcrits une "région destinée à être transcrite" qui correspond à la succession INTRON-EXON

EXON: région codante, aboutissant à une protéine
INTRON: région non codante, non traduite en protéine et qui n'a pas de fonction biologique identifiée. Donc de base, l'intron c'est "l'adn poubelle".
Logiquement tu ne vas pas amplifier les introns.

Car imaginons que tu réalise une PCR + séquençage des introns d'un gène (on est au niveau de l'ADN initial là) : si tu trouve une mutation au niveau de l'intron, cette mutation là , elle n'aura pas d'impact sur la future protéine vu qu'elle fait partie d'une séquence intronique et que les introns sont non codants donc non traduits et surtout supprimer au cours de la maturation du pré ARN.
Donc au final amplifier les introns, ca ne sert à rien, car l'éventuelle mutation retrouvée sera supprimée au cours de l'épissage.

Dans la ronéo 2 page 2:

On va séquencer tous les exons (codants) de ce gène : on le divise en morceaux et on fait plusieurs PCR individuelles (on ne peut pas amplifier de trop grandes régions). On a 2 primer différents pour chacun des exons, plusieurs réactions différentes avec des PCR différentes. On vérifie ces PCR sur un gel d’agarose et on les séquence.

Tu vois on précise bien qu'on amplifie les exons. Je pense que c'est toujours le cas.
Maintenant dans ce cas particulier du syndrome de wolfram, on est passé à côté d'une mutation.
Mais ca ne sert a rien d'amplifier les introns du gène WFS1, car c'est pas là qu'on pourra voir la mutation même si effectivement elle vient d'un intron.

Je m'explique:
Tu transcrit ton ADN initial, donc tes exons et tes introns. Tu arrive a un pré ARN immature.
Ton but c'est d'obtenir une séquence UNIQUEMENT codante pour arriver au final à une protéine.
C'est là que l'épissage intervient et que tu supprimes les introns (régions non codantes) vu qu'ils ne donnent rien.
Donc tu vois, là on est déjà au niveau de l'ARN. C'est pour ca qu'il y'a cette phrase dans la ronéo :

On va toujours du + simple au + compliqué : on commence par séquencer les parties exoniques (la plupart du temps les
mutations sont dans ces parties), puis si on ne trouve pas les mutations, on séquence les introns en travaillant sur l’ARN.

En fait on séquence pas vraiment les introns. On va séquencer la séquence codante de l'ARNm sous forme d'ADNc.
Cette séquence codante peut abriter un ancien morceau d'intron, qui se sera transformé en morceau d'exon (donc un morceau codant), et donc qui aura un impact sur la future protéine.
Mais cette mutation intronique / ce variant d'épissage, elle ne se passe que au moment de la maturation de l'ARNm.
A la base, au niveau de l'ADN initial, ce morceau d'intron est déjà destiné à être transformé en exon, "il porte sa mutation", mais elle n'est pas repérable au stade d'intron vu que ce dernier ne sera jamais traduit en protéine, donc ne s'exprimera pas.

Je crois que j'ai compris ton problème et je sais pas si j'arrive à y répondre correctement ...
Déjà il faut que tu comprennes pourquoi on ne fait pas de PCR+séquençage avec les introns directement.
Tant que ton intron ne subit de transformation pour qu'il devienne codant, on s'en fout, il est "inutile" au bon fonctionnement de la protéine.
Et c'est pas au niveau de l'ADN que t'as des réactions qui vont permettre à l'intron de se transformer.

C'est un peu flou désolée. Dis moi si c'est mieux...!

[Azula]

Waouh quel récap !

SI je peux juste t'apporter un complément d'info.
Comme te la bien dis Gollum :
PCR = amplification des exons = des régions codantes = les plus impliquées dans les mutations
En effet les mutations aux niveaux introniques sont la plupart du temps SILENCIEUSES
Et aussi il est bon de se rappeler que les séquences codantes c'est moins de 5% du génome, tu imagines si on amplifiait aussi les introns la quantité pharaonique de donnée que l'on aurait à traiter et en plus la plupart du temps pour rien...
Donc on va du plus simple au plus complexe !
Bien sûre on pourrait amplifier tout le gène (exons + introns), mais comment tu distinguerais les mutations introniques à l'origine de l'insertion ou de la délétion de nucléotides, des mutations introniques silencieuses
Tu es d'accord qu'en cas d'insertion ton ARNm sera plus lourd (donc migrera moins loin sur électrophorèse), et en cas de délétion il sera plus petit (migrera plus loin).
Donc en passant par l'ARNm tu auras accès directement à l'insertion ici de nucléotides introniques.
reverse transcriptase pour avoir de l'ADNc et pouvoir l'amplifier par PCR pour l'étudier le séquencer ect car l'ARN se prête mal à tout ça trop fragile...
après tu compares le séquençage de l'ADNc normal(l'ADNc est normal mais contient la mutation ponctuelle exonique), et l'ADNc muté ( +lourd)
tu remarques que il y a un gros bug à partir de la jonction exons 6/7

Et voilà tu as ciblé la région où il y a eu une mutation intronique c'est entre l'exon 6 et 7. Tu vas pouvoir amplifier cette région spécifiquement et effectuer un clonage pour séparer tes 2 populations et avoir 2 séquençages lisibles.

Voilà j'espère que ce n'est pas de trop^^

Bonne journée

[Gollume]

C'est beaucoup plus concis ! merci Azula

Kiss

[Bro-06]

Ok j'ai pris le temps de comprendre c'est parfait !

Merci à vous deux (surtout à Loanne, parce que Gollum.)