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Ronéo 4 Page 12


Ronéo 4 Page 12

Messagepar Moulutiche » 04 Oct 2014, 13:32

Salut Bonjour !
Après avoir galéré un bon moment sur cette putain d'inactivation d'un gène par introduction de mutation (ciblée), je me dirige vers ce merveilleux forum.

Alors.

Je vais vous dire ce que j'ai compris, pour voir où j'en suis.

On veut inactiver un gène. OK
On introduit un gène comportant des sq homologues. OK
Donc on remplace la séquence du gène à inactiver par une RESISTANCE A LA PUROMYCINE. <--LAAA, LAAA CA BLOQUE !

La puromycine sert de resistance aux antibios. Donc SI on RESISTE, à la RESISTANCE contre les antibios, ça veut dire qu'en gros on fait en sorte que le gène se fasse buter par les antibios?

Mais du coup ça ne coïncide pas avec la suite??

Du coup j'ai pas compris la suite : "On sélectionne ensuite les cellules résistantes à la puromycine en criblant beaucoup les cellules pour trouver où le gène puro n'aura pas été intégré au hasard. Mais par recombinaison homologue du gène à détruire. "

Donc comment on sélectionne les cellules résistantes, vu que celle qu'on veut inactiver n'est pas résistante aux antibios, puisqu'il y a UNE RESISTANCE A LA RESISTANCE CONTRE LES ANTIBIOS ?!

Aidez-moi.

Desbisous.

:coeur: #PACESWAG :coeur:
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Re: Ronéo 4 Page 12

Messagepar levure » 04 Oct 2014, 21:01

Oulalalala c'est vrai que ça me semble un peu confus :lol:

Tu sais qu'on a 3 cas de figure quand on transfecte un gène dans une cellule:

-soit il ne recombine pas et on perd le transgène au bout de quelques divisions
-soit il recombine quelque part dans le génome au hasard (recombinaison illégitime)
-soit il recombine pile à l'endroit où on souhaite le faire recombiner (recombinaison homologue)


Quand un gène recombine (s'intègre dans le génome de la cellule hôte), il va remplacer un bout d'ADN.

En gros l'ADN de ta cellule c'est un train, il est composé de milliards de wagon.
Le transgène que tu transfecte dans ta cellule c'est un wagon, et toi tu veux qu'il soit inséré dans le train.
Pour se faire, il faut qu'on enlève un wagon et qu'on mettre notre wagon transgène à la place.
Et bien c'est exactement ça qu'on veut faire :)

On veut inactiver un gène, on va tout simplement enlever le wagon (la séquence ADN) qui correspond à ce gène et le remplacer par notre transgène. On utilise la recombinaison homologue :arrow: on souhaite que notre transgène s'insère au niveau du gène à inactiver et pas ailleurs (c'est un phénomène très rare et on peut pas toujours le contrôler)


On va donc prendre pleins de cellules et leur injecter le transgène en espérant qu'il s'intègre.

Mais comment on va savoir quelles cellules ont intégré le transgène?
:arrow: le transgène qu'on va injecter contient un gène de résistance à un antibiotique, c'est à dire que ce gène code pour une protéine qui permettra à la cellule de survivre en présence d'antibiotique.

Du coup,après avoir injecté le transgène dans les cellules, on les mettra en présence d'antibiotique et seules les cellules ayant intégré le transgène survivront et il nous restera donc dans notre milieu de culture uniquement les cellules ayant intégré le transgène.

Parmi ces cellules, on aura des cellules qui ont intégré le transgène de manière illégitime et d'autres de manière homologue. On va donc rechercher dans ces cellules celles qui l'auront intégré de manière homologue grâce à des techniques dont le prof ne parle pas (on s'en fou :P)

Une fois qu'on aura repéré ces cellules, on les observera et on pourra étudier le rôle de la protéine codée par le gène qu'on a inactivé (par exemple, si il s'agit d'une protéine qui donne à la cellule une forme particulière, on observera des cellules avec une forme bizarre car on a inactivé le gène et on pourra conclure que la protéine codée par le gène qu'on a inactivé avait un rôle en rapport avec la forme la cellule)

J'espère que ça répond à ta question :)
(désolé j'suis un peu parti en vrille avec l'histoire des wagons) :mrgreen:
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