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Les réponses de l'an dernier, just HERE! :solide:
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Petite explication sur les sondes de capture :Les sondes de capture sont complémentaires des régions de gènes que l’on veut analyser. Cela sous-entend que l’on connaisse la séquence du gène Wild-Type (non muté).
La présence d’un variant nucléotidique ne bloquera pas la reconnaissance "sonde de capture/ADN génomique". La région sera donc capturée puis séquencée.
Le séquençage permettra d’identifier le variant. Autrement dit la région à séquencer n’est pas totalement inconnue, on cherche à savoir si dans ces régions il y a ou non des variants pathogènes.
Petite précision sur le séquençage NGS (non détaillée en cours car partie simplifiée par la Prof) :Le séquençage se fait à partir d’un primer complémentaire à l’amorce A (située à l'extrémité 3') du fragment d'intérêt.
Au moment de la purification avec l’aimant, on est double brin.
Avant le séquençage, on dénature à 95°C (ceci va libérer les brins biotynilés). Les brins fixés sur la sphère ne sont donc plus biotinylés.
On hybride l’amorce de séquence à l’extrémité 3’ du brin fixé à la sphère et la polymérase synthétise de 5’ en 3’.
Cette dernière étape de dénaturation/hybridation se fait juste avant de charger les sphères sur la puce (elle n’est pas représentée sur les schémas du cours).
L’extrémité des fragments accrochés à la sphère sont-ils 5’ biotinylés ou 3’ biotinylés ?A la fin de la PCR en émulsion, les extrémités 5’ sont biotinylées. Après purification avec l’aimant, aussi. Au moment du séquençage, on est en simple brin sans biotine (perte suite à la dénaturation).
Dans un vecteur d'expression utilisé dans une cellule eucaryote, à quoi servent le gène de sélection procaryote et l'origine de réplication procaryote ? La préparation des vecteurs d’expression (utilisés dans une cellule eucaryote) se fait dans les bactéries, c’est-à-dire la ligation de l’insert dans le vecteur, la transformation dans les bactéries, l’isolement sur boite de pétri pour sélectionner les bactéries qui ont intégré l’insert, la préparation en grande quantité du vecteur. Il faut donc pour ces étapes le gène de sélection et l’origine de réplication procaryote. Une fois purifié à partir des bactéries, le vecteur d’expression est transfecté dans les cellules eucaryotes. On ne fait donc pas une étape dans un vecteur de clonage avant d’utiliser le vecteur d’expression, on utilise directement le vecteur d’expression.
Est-il correct de dire que « le protocole et le principe d'extraction de l'ADN et de l'ARN sont communs » étant donné qu'on retrouve plus ou moins les mêmes étapes (lyse, extraction, précipitation) ?Oui, les étapes de l’extraction sont similaires (lyse des cellules, traitement par la protéinase K pour enlever les protéines, extraction des acides nucléiques par le phénol/chloroforme, précipitation des acides nucléiques par ajout d’éthanol/sels), la seule différence est l’utilisation d’un phénol à pH acide spécifiquement pour les ARN.
Faut-il bien faire la différence entre adaptateurs et Barre Code ? Les adaptateurs A et P1 étant un couple d'amorces, et le Barre Code étant une séquence supplémentaire de nucléotides que l'on rajoute afin "marquer" le fragment d'un patient pour pouvoir le reconnaitre après (avec 1 BC différent pour chaque patient).Votre explication est juste : Les Barre Codes permettent « d’identifier » un patient. Ce qu’il faut surtout comprendre c’est l’intérêt d’utiliser les adaptateurs A et P1 : cela permet avec un seul couple de primers (complémentaires des adaptateurs A et P1) d’amplifier toutes les régions d’ADN fragmentées quelque soit leur séquence.
La différence entre adapteurs et BC : les BC ont des séquences différentes entre les patients. Tous les adaptateurs A ont la même séquence pour tous les patients et tous les adaptateurs P1 ont la même séquence pour tous les patients. Par contre A et P1 sont de séquences différentes.
