Hello! Alors, pour une explication plus complète de la
PCR en émulsion, j'avais fait un récap dans ce post :
viewtopic.php?f=717&t=80584Bon, ici, on reprend juste à la fin de la PCR en émulsion :
Vous voyez que le
fragment de départ (encadré en rouge) et le
fragment d'ADN biotinylé obtenu (encadré en bleu) ne sont pas totalement identiques : il y a eu ajout d'une
petite séquence supplémentaire (en rose),
complémentaire de la séquence du primer de la sphère.
Donc, vous comprenez bien que
l’hybridation avec le primer situé sur la sphère ne peut se faire qu’avec le dernier brin nouvellement synthétisé, et
pas avant, c'est pourquoi on a besoin des premières étapes et que l'amplification ne débute pas directement sur la sphère.
(Je crois que ça répond à ta question LAMsa ^^)Donc, après, une fois le fragment biotinylé hybridé sur la sphère, l'ADN polymérase va synthétiser le brin complémentaire à partir du primer de la sphère, et on aura de l'ADN double brin fixé à la sphère avec une
extrémité 5' biotinylée (confirmé par la Prof), comme représenté ci-dessous :
Au bout de n cycles, on se retrouvera avec une sphère recouverte de fragments PCR amplifiés, avec à chaque fois l'extrémité 5' biotinylées.Ensuite, vient l'étape de
purification des sphères avec ADN amplifié grâce à l'
hybridation biotine/streptavidine et l'utilisation d'un
aimant.
A ce niveau-là, notre ADN d'intérêt est encore sous forme
double brin et possède une
biotine en 5'.
Puis, juste
avant le séquençage, on va
dénaturer notre ADN double brin à 95°C afin de
libérer les brins biotinylés en 5', car le brin qu'on va ensuite séquencer c'est le
brin non biotinylé :
(étape non décrite en cours)Vous remarquez donc que la sphère qui va partir au séquençage n'est
pas biotinylée (sur le schéma à la diapo 18, il faut enlever la biotine aux extrémités des brins pour que ça soit juste, confirmé par la Prof).
Donc, une fois l'étape de dénaturation finie, pour débuter le
séquençage, on va
hybrider une amorce à l'extrémité 3' du brin fixé à la sphère. Cette amorce est
complémentaire du primer A (en rouge) du fragment d'intérêt :
(schéma rectifié par rapport à celui de la diapo 18)Cette dernière étape de dénaturation/hybridation
(non détaillée en Cours parce que la Prof voulait vous simplifier exprès le truc ^^) se fait
juste avant de charger les sphères sur la puce.
Donc, si on résume l'histoire de la biotine, on a :
A la fin de la
PCR en émulsion = Extrémités
5’ biotinylées Lors de la
purification avec l’aimant = Extrémités
5' biotinylées Au moment du
séquençage = ADN
simple brin sans biotine (perte suite à la dénaturation)Est-ce que c'est mieux?