Clonage

[Hervier]

Hello

Je comprends pas trop le passage du cours où suite au syndrome de Wolfram on a découvert que c'est du à une mutation lors de l'epissage et pour ça on avait fait une PCR sur l'ADNc de l'ARNm muté. Et là vient le probleme: le patient possède deux ARNm/ADNc differents du coup on peut pas faire de séquence directement pcq la lecture serait illisible. C'est ce passage que je comprends pas.. On a bien fait une PCR sur notre ARNm/ADNc qui était défectueux, pq on passe pas directement au séquencage... en laissant l'autre ARN de coté?

Je sais pas si c'est très clair mon histoire.. Mais si quelqu'un peut m'aider..

Merci d'avance

[Niavlys]

Salut

Alors si j'ai bien compris ta question, ton soucis vient d'un soucis de compréhension,

- Le but d'une PCR c'est ? Amplification d'une petite quantité d'ADN
- Avec un séquençage tu vas déterminer la succession de nucléotides que composent l'ADN

Du coup avec ta PCR tu vas prendre une toute partie de l'ADN et l'amplifier, avec le séquençage, tu auras besoin de tout ton ADN, c'est pour ça que la séquence est illisible et que l'on aura besoin du clonage

Est-ce que c'est clair ?

Bonne soirée

[Hervier]

Hello

C'était pas trop ma question..., le passage que je comprends pas c'est pq quand on a fait la reverse transcriptase pour obtenir l'ADNc à partir de notre ARNm muté on passe pas directement au séquencage vu qu'on a isolée notre ARNm muté au moment de le transformé en ADNc? Et du coup je vois pas en quoi le clonage moléculaire les sépare? J'espère que je suis compréhensible...
merci d'avance

[Matildou]

+1 j'ai pas compris non plus

[AdriCaps]

+ 1 quelle bonne question tu tiens là

[carlaccouche]

+ 1 aussi

[Luffylink]

Salut

Si on doit d'abord séparer les ADNc par un clonage, sans passer directement par un séquençage une fois l'ADNc obtenu, c'est pour éviter la bouillie infâme (illustrée en page 9) qui apparaît lorsqu'on met dans le séquenceur deux ADNc de taille différente

Le séquenceur est incapable de faire seule la différence entre les ADNc, et va donc superposer les séquences du variant d'épissage et de la version normale, ce qui est illisible.

Il faut donc d'abord isoler chaque ADNc par une étape de clonage avant de passer au séquençage de chaque séquence

C'est plus clair ?

[Mélanoblaste]

+1
Mais pourquoi les ADN ne sont pas séparés directement après la reverse transcriptase ou au moment de la PCR avant même le séquencage et le clonage ?

[Hervier]

Voilà c'est ca ma question!

[Luffylink]

Je vais poser la question demain au prof, pour demander un éclaircissement sur ce point

Il y a sur ce post une question assez similaire.
Pouvez vous vérifier si vos interrogations se rejoignent ?