Tutorat 2 qcm 4 item c

[MarionBuisset]

Bonsoir,
Pour cet item je suis d’accord que les cellules sont entrées en sénescence mais puisqu’on ne voit plus de fluorescence lorsqu’il y a de la doxycycline, c’est que les cellules ont disparues et elles auraient donc aussi subies le phénomène d’apoptose non ?
Merci de m’expliquer si je me trompe

[Mymi]

+1 surtout qu'il y a marqué "on peut suggéré" , ça peut être une hypothèse qu'on peut ne pas exclure

[Kanye Western-Blot]

Hellooo !

Ici on a fait ce qu'on appelle une expérience de "clonogénicité", c'est à dire qu'on veut observer si tes cellules se sont divisées ou pas.

Au départ de l'expérience on a planté un très petit nombre de cellules. On a mis du dox 30 et du dox 1000 et on voit que 10 jours après il n'y a pas de colorations sur la cellule. Pourquoi ? Parce que les cellules qu'on a mis à la base ne se sont tout simplement pas divisées.

Pourquoi ? Parce qu'elles sont rentrées en senescence !

Mais pourquoi ne pourrait-on pas considérer que toutes les cellules qu'on a planté soient entrés en apoptose plutôt ?

Car dans les 3 expériences précédentes on a établi que la doxycycline provoquait une expression relative de B-RAF beaucoup + importante, et quel est le rôle de BRAF ? Est-ce un inducteur d'apoptose ? Non.

Je cite l'énoncé: . "L’oncogène avec lequel nous avons travaillé est B-RAF, avec la mutation V600E dont le rôle dans l’induction de senescence a été montré aussi bien in vitro que in vivo "

Donc puisque qu'on a mis de la doxy et que celle-ci provoque l'expression de B-RAF et que B-RAF entraîne la sénescence, rien ne nous laisse suggérer que les cellules sont rentrées en apoptose !

Je sais que ça peut être tentant de mettre "vrai" dès qu'on voit suggérer mais il faut pas trop non pluus (même si j'avoue que c'était chaud d'avoir tout ce raisonnement en si peu de temps, mais bon l'important c'est la correction ! )

C'est bon pour vous ?

[MarionBuisset]

Oui je suis d'accord avec l'explication, j'ai compris que la doxycycline était un inducteur de sénescence et pas d'apoptose ! Mais au début on a planté des cellules et si ces cellules étaient justes en sénescence et donc n'étaient pas mortes, on aurait dû voir de la fluorescence même dans les cultures avec de la doxycycline, il y aurait simplement dû avoir beaucoup plus de fluorescence dans la culture sans doxycycline ! Mais là dans les cultures avec doxycycline il n'y a pas du tout de fluorescence donc plus du tout de cellules, ce qui veut dire que les cellules plantées au debut ont disparues et donc qu'elles sont d'abord rentrées en senescence à cause de la doxycycline mais qu'elles ont aussi fini par mourir et donc qu'elles ont subi le phénomène d'apoptose !
J'espère que vous suivez mon raisonnement, si les cellules n'ont pas aussi subies le phénomène d'apoptose alors où ont-elles disparues ?!
Merci

[Mymi]

+ 1

[Kanye Western-Blot]

Re

Non encore une fois tes cellules sont tout simplement trop petites pour qu'on puisse visualiser leur fluorescence !

De plus tu sais bien que les cellules sénescentes sont résistantes à l'apoptose (c'est dit dans le cours), une fois passées en sénescence elles ne vont pas passer en apoptose, ça c'est du cours !

L'expérience nous montre que la doxycycline induit un arrêt de prolifération in vitro, et non pas une mort des cellules par apoptose, je cite la thèse de laquelle j'ai extraite l'expérience:

" Sur une durée de 10 jours, on observe que les cellules non induites sont capables de proliférer jusqu’à former des colonies visibles (Figure 19). Lorsque l’on traite les cellules à 1000ng/ml, qui induit un arrêt total des cellules en 2 jours, on ne voit pas la formation de clone. Lorsque que l’on induit faiblement l’expression de B-RAFV600E, à 30ng/ml, on n’observe pas la formation de clone. Cela nous permet donc d’affirmer que même à des faibles doses d’expression de B-RAFV600E, on induit un arrêt de la prolifération in vitro. "

--> Si l'on observe pas la fluorescence c'est que les cellules ne sont pas assez nombreuses pour observer des colonies visibles.

Si on avait utilisé un microscope performant on aurait pu visualiser la fluorescence même sur les cellules exposées à de la doxy. Mais ce n'est pas le but de l'expérience, l'expérience de clogénicité sert à démontrer que la doxy. induit un arrêt de prolifération cellulaire, on savait d'avance qu'on n'allait pas avoir d'apoptose puisque on utilise la doxy qui induit la sénescence et non pas l'apoptose.

J'espère que c'est bon pour vous.

[MarionBuisset]

Ah ok merci, ça ne me paraissait pas évident qu’on ne puisse pas voir la fluorescence 6000 cellules mais maintenant je le saurai !