Salut
Alors au niveau de ton raisonnement en première partie il est juste !
Et au niveau de tes questions :
C'est donc le fait d'ajouter un intercalent et de mesurer la fluorescence à chaque élongation qui fait que la pcr classique "devient" une pcr en temps réel ? ou alors la pcr en temps réel nécessite la transformation de la courbe exponentielle en une courbe linéaire?
Je vais essayer de t'expliquer tout ça au mieux mais je te le dis dès à présent : c'est juste pour toi pour comprendre ----> il semblerait vachement que la prof en ait clairement rien rien à faire de l'explication en détail ++ des courbes
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Récap des techniques: -PCR simple :
But? Amplifier une séquence précise d'ADN
Procédé ? ADN polymérase, tampon, dNTPs et amorces afin de cibler la séquence voulu
On choisi le nombre de cycle qu'on veut faire en sachant que:
-1 cycle = dénaturation, hybridation, élongation chacune à des températures spécifiques
-avec n le nombre de cycles qu'on a choisi de faire on obtiendra 2
n séquences d'ADN qui nous intéressent à la fin
-PCR en temps réel :
But? Amplifier une séquence voulue d'ADN (à la fin de la technique SYBRGREEN on peut récupérer les fragments pour continuer avec d'autres techniques de Biomol si on le souhaite)
ET chercher à savoir la quantité d'un gène présent chez un individu --> ex: vitalité pour le Covid-19 savoir combien il y'a de gènes du virus dans les cellules
Procédé ? On va intégrer
en plus des composants précédent un agent fluorescent qui va fluorescer seulement lorsqu'il est intégré dans l'ADN (+++)
À la fin de chaque cycle l'appareil va mesurer la fluorescence dans le tube --> plus il y'a d'ADN de base plus les agents vont s'intercaler et plus la machine va détecter de fluorescence. Chaque mesure va être intégrer dans un graphique et une courbe va donc se dessiner.
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Au niveau des courbes : Attention ! On a une courbe qui reflète la fluorescence mesurée en fonction du nombre de cycle PCR fait (1ere cycle : tant de fluorescence etc)
Donc on réalise cette courbe de fluo que dans la PCR en temps réel
Avec le schéma du procédé ci-dessous on comprends que plus on a d'ADN de base plus la quantité de fluorescence mesurée au cycle 1 va être grande et comme c'est une exponentielle on va avoir de plus en plus de fluorescence et inversement si la quantité est faible
Maintenant si on décrit un peu la courbe :
a) ce que j'ai mis en a est la première phase de plateau : cette phase s'explique car dans les premiers cycles la quantité d'ADN est trop faible donc la fluorescence émise n'est pas encore assez importante pour que la machine la détecte
L'amplification exponentielle continue...
Ce plateau dure jusqu'au trait vert que j'ai fais sur le schéma.
Ce trait correspond à un certain nombre de cycles =
cycle seuil Ct ici on voit qu'au bout de 28cyles de PCR on quitte la phase de plateau et la fluorescence démarre sa phase de production exponentielle !
Le cycle seuil Ct est donc le
nombre de cycle qu'il faut pour que la fluorescence commence à être mesurée de manière significative. Si on fait le lien avec ce qu'on explique plus tôt ---> plus la quantité d'ADN de base (= nombre de virus chez l'individu) est grande moins il faudra de cycle pour démarrer cette courbe vu que grand nombre d'ADN de base = beaucoup d'agent fluo qui peuvent s'intercaler
dès les premiers cycles = beaucoup de fluorescence
C'est en regardant le cycle seuil Ct qu'on va pouvoir déterminer la quantité d'ADN à l'origine chez le patient et donc déterminer sa charge virale ! b) phase exponentielle la fluorescence (et donc les fragments) sont produits exponentiellements
c) au bout de 40cycles quels que soit la quantité d'ADN à l'origine on obtient un plateau ---> le système est saturée plus de dNTPs, polymérase ne fonctionne plus
---> si on mesurait donc la fluorescence à la fin des 40cycles (comme une PCR classique avec en plus les agents fluo mais pas de mesure a chaque fin de cycles) on obtiendrait la même valeur quel que soit la quantité de virus chez le patient de base : ça n'a donc pas d'intérêt
C'est plus clair ? D'autres questions ?
