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Confusion


Confusion

Messagepar Ludi » 23 Avr 2012, 11:36

Coucou :D ,

Voilà je fais un copié/collé de mon cours :

•Puis il y a ligation entre vecteur et insert avec la T4 DNA Ligase qui catalyse la formation d’une liaison phosphodiester entre 3’ OH et 5’ Phosphate.

•La déphosphorylation est nécessaire pour empêcher la fermeture sur lui même du vecteur avant qu’il n’ai intégré l’insert (cad quand le vecteur à des coupures franches).
Une phosphatase va retirer le phosphate du 5’ de l’extrémité du vecteur.


C'est ce qu'à dit la prof au niveau du clonage du plasmide...

Je comprends pas pourquoi :

1. On fait une déphosphorylation pour empêcher la ligation après une ligation Oo WTF ? :lol: :lol:
2. On parle de déphosphorylation pour bout francs alors que ce sont ceux qui ne se lient pas spontanément, qui nécessite une T4 DNA ligase..

Bisous et merci !!
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Re: Confusion

Messagepar gabriel » 23 Avr 2012, 13:12

on fait une dephosphorylation pour empecher que le vecteur (avant d'avoir mis les inserts potentiels dans la solution et la ligase) ne se referment sans insert: en fait pour eviter , quand on mettra les inserts a bouts francs et la ligase, que le vecteur ne se referment sans insert, on dephosphoryle les extremintes du vecteur. comme ça une fois les inserts et la ligase, etc., ajoutés dans la solution, la ligase ne peut refermer les vecteurs qu'a l'aide des groupements phosphates des inserts et OH du vecteur dephosphorylé.
donc on fait une dephosphorylation pour empecher une ligation sans insert!on la fait avant de rajouter la ligase et les inserts pour le derniere etape de ligation.
donc meme si les bouts frans ne se lient pas spontanément, quand on va rajouter les inserts et la ligase, les bouts francs du vecteurs peuvent donc se refermer sans inserts.
jespere que c clair
bizzz
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Re: Confusion

Messagepar Ludi » 24 Avr 2012, 12:14

Ok merci j'ai compris pour les bords francs..
...Mais maintenant problème avec les bords cohésifs ^^

J'ai noté (1ère prof) :

• A bouts cohésifs (sticky ends) : coupure asymétrique des brins, au même niveau de la séquence -> peu entraîner ré-hybridation incontrôlée sur la zone simple brin de chaque côté (« brin sortant »).


La 2ème prof j'ai pas entendu si elle faisait une distinction entre bords cohésifs et bords francs au moment de l'intégration de l'insert.
Du coup je partirai du principe qu'avec les extrémités cohésives il y aura également besoin de la déphosphorylation pour empêcher que le vecteur ne se referme sur lui-même sans avoir intégré l'insert, mais là même sans avoir ajouté la T4 DNA ligase. (cf les dires de la première prof)

Merci,

Bisous :D
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Re: Confusion

Messagepar Caesar » 24 Avr 2012, 13:49

Ludi a écrit:Du coup je partirai du principe qu'avec les extrémités cohésives il y aura également besoin de la déphosphorylation pour empêcher que le vecteur ne se referme sur lui-même sans avoir intégré l'insert, mais là même sans avoir ajouté la T4 DNA ligase. (cf les dires de la première prof)

Salut Ludi
Alors je crois que la prof a dit que ce n etait pas necessaire pour les bords cohesifs, mais c est juste fonde sur de vagues souvenirs :mrgreen:
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Re: Confusion

Messagepar gabriel » 24 Avr 2012, 13:52

coucou
je crois ke la probabilité élevée que le vecteur se referme sans insert et donc le besoin de déphosphorylation, c'est surtout pour les bords cohésifs. on n'a pas trop ce problème avec les bords cohésifs, du coup pas besoin de déphosphorylation dans ce cas puisque les vecteurs se referment tout aussi bien avec les inserts. dslé je ne suis pas un pro du clonage mais je vais essayer de me renseigner voir si je trouve plus d'info la dessus. mais bon sache deja que la déphosphorylation, c'est dans les cas des bords francs.:)
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Re: Confusion

Messagepar Caesar » 24 Avr 2012, 13:54

gabriel a écrit:coucou
je crois ke la probabilité élevée que le vecteur se referme sans insert et donc le besoin de déphosphorylation, c'est surtout pour les bords FRANCS. on n'a pas trop ce problème avec les bords cohésifs, du coup pas besoin de déphosphorylation dans ce cas puisque les vecteurs se referment tout aussi bien avec les inserts. dslé je ne suis pas un pro du clonage mais je vais essayer de me renseigner voir si je trouve plus d'info la dessus. mais bon sache deja que la déphosphorylation, c'est dans les cas des bords francs.:)

:wink:
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Re: Confusion

Messagepar gabriel » 24 Avr 2012, 14:05

oui lol bien sur: c'est surtout pour les bords francs!merci caesar
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Re: Confusion

Messagepar Caesar » 24 Avr 2012, 14:07

Ex nihilo :)
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Re: Confusion

Messagepar Ludi » 24 Avr 2012, 14:08

Re,

Je trouve que cela n'a pas trop de sens ^^ je vois pas la logique en fait ...

On dit que les bords francs ne se referment pas seuls mais qu'ils ont besoin de déphosphorylation avant la ligation (OK) mais que les bords cohésifs avec lesquels on pourrait jouer à un Tétris lol (ma vision de la biomol :p) n'auraient pas besoin de cela..je m'embrouille ^^

Je veux bien tes recherches ^^ merci gaby :D

Bisous
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Re: Confusion

Messagepar Caesar » 24 Avr 2012, 14:14

Ludi a écrit:
On dit que les bords francs ne se referment pas seuls mais qu'ils ont besoin de déphosphorylation avant la ligation (OK)

Non c est l inverse ils se referment tout seul justement, la dephospho c est pour etre sur que l insert soit bien la :wink:
Ludi a écrit:
mais que les bords cohésifs avec lesquels on pourrait jouer à un Tétris lol (ma vision de la biomol :p) n'auraient pas besoin de cela..je m'embrouille ^^

MDR mais c est difficile Tetris quand meme :lol:
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Re: Confusion

Messagepar gabriel » 24 Avr 2012, 14:15

tu sais parfois ya pas trop de logique: c'est souvent à partir de constats. mais si je trouve plus d'info je te tiendrai au courant bizzz
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Re: Confusion

Messagepar Ludi » 04 Mai 2012, 17:35

800ème message !!!!! :D

Bon j'ai toujours un problème sur ce passage (le seul du cours :()

- 1ère partie - 1ère prof :

Capture d’écran 2012-05-04 à 18.31.55.png


- 2ème partie - 2ème prof :

"Une déphosphorylation est nécessaire avant la ligation de fragments d'ADN clivés par des enzymes de restrictions qui génèrent des extrémités franches"


Big contradiction :/ sinon j'aimerai qu'on m'explique vraiment bien car là ça me paume !

Merci

Bisous !!!
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Re: Confusion

Messagepar gabriel » 05 Mai 2012, 09:02

Quand les enzymes de restriction generent des bouts francs,le vecteur aura plus de chance de se refermer tout seul avant le rajout dinserts!dou le besoin de dephosphorylation du vecteur pour que le seul moyen de refermer le vecteur serait avec les inserts en utilisant leur gr phosphate et grace a une ligase.c tout je crois il faut juste savoir ca
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Re: Confusion

Messagepar Blay » 11 Mai 2012, 15:18

Ludi, ce qu'il faut savoir, ne va pas chercher plus loin :

On peut obtenir après passage des enzymes restriction 2 Bouts francs dans ce cas là :

:arrow: le vecteur va vouloir se refermer directe tu vois parce que ça colle bien, ils sont parreil de chaque coté (comme un tetris sauf que c'est les même extrémités des deux cotés) donc ils cherchent pas trop à comprendre ce qu'il se passe et hop se recolle ensemble. Seulement nous on veut pas ça. Je te rappelle que le but est de mettre un insert au milieu, mais comme le vecteur il a pas vraiment de cerveau il se dit pas "bon attendons que l'insert soit en place puis on se refermera", non lui il prend ce qu'il a soit sont autre extrémité et il se referme, et comme nous c'est toujours pas ce qu'on veut et bien on fait une DEPHOSPHORYLATION.
Du coup comme tu l'as dit toi même une phosphatase va retirer les 2 phosphate du 5’ de chaque extrémité du vecteur par un groupement -OH. Puisque pour se refermer le vecteur a obligatoirement besoin d'un phophate et d'un groupement -OH, là il pourra plus se refermer puisqu'il y aura que des groupement -OH, et plus de phosphate qu'on a "anéanti" je te rappelle par déphosphorylation.
On intervient alors de nouveau : On ajoute la ligase et l'insert, qui présente à ses extrémités comme par magie 1 groupement phosphate de chaque coté et du coup, le vecteur lui parreil que toute à l'heure il va pas réfléchir groupement phosphate = je me colle. Finalement on aura bien intégré notre insert dans le vecteur.

Maintenant comme toujours il y a des exceptions dans ce premier cas de figure car on peut retrouver malgré la déphosphorylation des vecteurs qui n'en ont fait qu'à leur tête et qui se sont refermé (on sait pas trop comment) qu'avec leurs extrémités -OH, du coup pour certains (mais en très très très faible quantité) ils n'auront pas intégré d'insert. Bref, ceux-là, si je ne m'abuse on s'en fou un peu. Le tout c'est de comprendre toute l'étape.


Tout ça pour dire que dans tes deux phrases il n'y a pas de contradiction. La diapo est mal faite, certes, mais y'en a pas, :D
Je pense me souvenir que tu nous a pas tout donné les informations en plus, ta diapo est coupé, car la petite étoile correspond à l'autre parti celle des coupures à bouts cohésifs, mais je te l'accorde ils ont oublié des faire correcpondre la petite étoile dans la diapo au bonne endroit.


J'espère que ca t'aidera... :?
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Re: Confusion

Messagepar gabriel » 11 Mai 2012, 16:18

quelle entraide entre P1!!bravo!!!:)
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Re: Confusion

Messagepar Ludi » 12 Mai 2012, 13:35

Merci beaucoup Blay :D
Bisous !!
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Re: Confusion

Messagepar gabriel » 12 Mai 2012, 18:17

:D
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