Sélection des clones bactériens

[sansa]

Salut

Alors voilà je me demandais si pour la sélection, on faisait ampicilline et sélection blanc/bleu ou il faut choisir l'une des deux méthodes pour la sélection ?

Parce qu'à vrai dire je ne sais pas quelle serait l'utilité d'utiliser les 2 méthodes, vu qu'on élimine déjà les bactéries sans insert donc non résistantes avec l'ampicilline.

Merci à vous !

[sansa]

Je ne comprends pas est ce qu'au bout de ces étapes, les plasmides sont capables de perdre leur insert ? parce qu'il y a aussi la carte de restriction pour vérifier qu'ils ont l'insert...

[Escarboucle]

Salut,

Alors en fait si j'ai bien compris les deux méthodes doivent être utilisées.

1) On fait une sélection à l'ampiciline, du coup toutes les bactérie sans vecteur meurent. MAIS il nous reste des bactéries qui on un vecteur SANS insert! Car tous les vecteurs (plasmides) n'ont pas forcément intégré un insert (l'ADN qui nous intéresse).
Donc cette première sélection nous permet d'enlever les bactérie sans vecteur mais il nous reste des bactéries avec des vecteur sans l'insert et d'autre bactérie avec des vecteurs qui ONT l'insert (celle qu'on veut garder au final)!

2) On fait alors une selection blanc bleu, si le vecteur a bien intégré l'insert le gène gal est inactif (car il y a tout notre insert au milieu du gène ce qui le rend non fonctionnel).
Donc si on a des cellules bleues : le gène gal est actif donc il n'y a pas l'insert dans le vecteur. (on ne garde pas ces cellules car même si elles ont intégré un vecteur qui leur a permis de resister à l'ampiciline elle n'ont PAS notre insert).
Si on a des cellules blanche: Gal est inactif donc l'insert est bien dans le vecteur (qui est dans la bactérie précédemment sélectionnée grace à l'ampicyline) on garde ces cellules là

APrès comme dit dans la ronéo on fait une carte de restriction "pour vérifier si l'insert qu'on a récupéré est le bon" donc je suppose que c'est pour vérifier que ça a pas intégré n'importe quoi ou qu'il y ait pas d’erreur parce que la carte de restriction permet de voir la taille donc c'est plus précis. Mais j'aimerais bien une petite précision aussi sur ce point +1

Voilà je pense pas avoir dit de bétises, bonne soirée en tout cas!

[sansa]

Merci beaucoup Escarboucle, je comprends mieux, j'ai aussi hâte de voir ce qu'en pensent les tuteurs !

[Luffylink]

Salut

La réponse d'Escarboucle est très détaillée, mais pour la question du pourquoi du comment, elle aurait pu être simplifiée

La sélection préalable à l'ampicilline permet d'éliminer 99% des bactéries n'ayant intégré de vecteur quelconque (Il se peut que certaines survivent), et de sélectionner chaque colonie portant (ou non) un insert différent.

Puis la sélection blanc-bleu permet de déterminer dans ces colonies, quelles ont été les bactéries qui ont intégrées l'insert.
Les colonies de ces dernières bactéries sont récupérées et amplifiées
Mais on utilise toujours de l'ampicilline pour diminuer le nombre de bactéries parasites qui n'auraient pas intégré de vecteur (Juste pour être sur)

Je ne suis pas dans la tête des chercheurs, mais je dirais que c'est ce que tu peux retenir

C'est pour toi ?

[sansa]

Yes merciiii !