Séparation des AA par Ionisation et pHi

[Half]

Hey !

Je n'ai pas compris cette méthode de séparation... Déjà, séparation = purification ?

Ensuite, quel est le rapport entre l'ionisation et le pH ?

Enfin, en gros comment fonctionne cette méthode ? Voila ce que j'ai compris :

On prend des AA chargés + ou - et on mesure leur pH puis on les classe du plus fort pH au plus faible (ou inversement).

Sauf que je me rend compte que c'est plus complexe que ça mais je n'arrive vraiment pas à refaire la démarche que le prof avait appliqué en cours pour comprendre cette méthode. (Si besoin est les poly sont pages 80/81)

Merci !

Ps : Tant que j'y suis. Quels sont les diminutifs pour ces 4 AA :

>Asparagine : Asp ? Asn ? Asx ? D ? N ? B ?
>Glutamine : Glu ? Gln ? Glx ? E ? Q ? Z ?
>Aspartate : Asp ? Asx ? B ? D ?
>Glutamate : Glu ? Glx ? E ? Z ?

Ces 4 AA sont-ils vraiment 4 AA différents ? Je veux dire on a bien Asparagine =/= Aspartate ? C'est assez confus pour moi :s

[marquito]

Salut

1) But de l'opération : Après avoir cliver ta protéine tu veux savoir quels AA composent ta protéine. Donc tu vas SEPARER les différents AA présents dans ta solution après clivage de ta protéine. La Purification c'est le fait d'isoler la molécule qui t'intéresse à partir d'un mélange complexe (Donc isoler une protéine ou un AA).

2) Les couples acide/base (NH₃⁺/NH₂ ou COOH/COO^- ...) présents dans ton AA ou ta protéine seront plus sous la forme acide ou sous la forme base en fonction de leur pKa. Pour que tu comprennes mieux je te poste la réponse que j'avais écrite sur l'utilisation de la méthode des bols sur l'aspartate.

EXEMPLE :
Prenons l'aspartate = acide aspartique = D
Cet acide aminé à 3 pKa tu as du voir les pKa au lycée normalement (sinon on peut se rafraîchir les idées par ici http://physique.chimie.pagesperso-orange.fr/Cours_de_chimie/Chimie_5_COUPLE_ACIDE_BASE_CONSTANTE_D'ACIDITE.htm).
pKa 1 = 9,8 (c'est le pKa de l'extrémité N-ter de l'aspartate donc du couple acide/base NH₃⁺/NH₂)
pKa 2 = 2,1 (c'est le pKa de l'extrémité C-ter de l'aspartate donc du couple COOH/COO^-)
pKa 3 = 3,9 (c'est le pka de la chaîne latérale de l'aspartate ici le COOH de sa chaîne latérale donc du couple COOH/COO^-)
Ensuite ce qu'il faut savoir c'est (Imaginons un couple acide/base):
- pKa < pH : la forme acide de ton couple acide/base prédomine
- pKa = pH : il y a autant d'acide que de base
- pKa > pH : la forme base prédomine

Maintenant tu peux faire la méthode des bols :
Tu commences par tracer une flèche qui va symboliser le niveau du pH. Tu as 3 pKa donc tu dessines 3 bols (en dessous de chaque bol tu écrit les pKa dans l'ordre croissant), tu devrais avoir ça :


Enfin on réfléchit sur les charges.
Quand notre pH sera inférieur à 2,1 alors tous nos couples acide/base seront sous leur forme acide donc protonée du coup on aura :
- NH₃⁺ en N-ter de l'AA
- COOH en C-ter
- COOH sur la chaîne latérale de l'aspartate (qu'on appelle aussi R)

Donc de tout ce que l'on voit on a à pH < 2,1 une charge de +1 donné par le NH₃⁺, les autres COOH et COOH ne sont pas chargés. Donc tu peux marque +1 au dessus de l'intersection entre le premier bol et la flèche.

Ainsi de suite : à un 2,1 < pH < 3,9 on a :
- NH₃⁺
- COO^-
- COOH
Le + et le - s'annule ton AA n'est pas chargé donc on met un 0 à la deuxième intersection.
Et si tu continues le raisonnements tu arrives à ça normalement :


A partir de là tu trouves le pHi = (2,1+3,9) / 2 = 3
Car t'as charge de 0 est entre les pKa 2,1 et 3,9, tu les additionnes et tu fais la moyenne en divisant par 2.

LES COLONNES ECHANGEUSES D'IONS (nom de la manip p80/81) :
Pour bien comprendre cette méthode il faut que tu comprennes ce qu'est un pHi (avec l'exemple de l'aspartate je pense que c'est bon !). Donc on en revient à notre protéine que l'on a clivée et où l'on veut séparer les différents AA.
On va mettre notre solution avec tous les AA dans une colonne échangeuse d'ions ; soit échangeuse d'anions soit de cations.

1) On explique d'abords la colonne échangeuse de cations. Cations vient du fait que les billes que l'on met à l'intérieur de colonne sont chargées "-" pour que les cations (ici les AA) puissent s'accrochés. Pour que les AA puissent être chargé "+" il faut que le pH soit acide (les AA seront protonnés c'est à dire que tous les couples acide/base qui le composent seront plus sous la forme acide). Donc on met nos AA à pH très acide dans notre colonne. Les AA sont liés aux billes chargés "-".
On va maintenant augmenter petit à petit le pH. Qu'est ce qui va se passer ? Petit à petit les AA vont se décrocher des billes car on va atteindre leur pHi (isoélectrique). Comme les AA ont des pHi différents, on va d'abords récupérer les AA à pHi faible et en dernier les AA à pHi fort. Ainsi on sépare nos AA selon leur pHi.

Résumé :
- A pH acide on met nos AA dans la colonne
- On augmente le pH
- On fait tomber les AA au pHi du plus faible au plus fort

Je te laisse faire le raisonnement pour la Colonne échangeuse d'anion.

Tant que j'y suis. Quels sont les diminutifs pour ces 4 AA :

>Asparagine : Asp ? Asn ? Asx ? D ? N ? B ?
>Glutamine : Glu ? Gln ? Glx ? E ? Q ? Z ?
>Aspartate : Asp ? Asx ? B ? D ?
>Glutamate : Glu ? Glx ? E ? Z ?

Asparagine : N
Glutamine : Q
Aspartate : D
Glutamate : E

L'aspartate c'est de l'acide aspartique avec sa chaîne latérale déprotonné (COO^-). donc asparagine (fonction amide) et aspartate (fonction carboxylique) c'est bien 2 AA différents.

Fin

[Half]

Whaou merci tout y est c'est vraiment super sympa de ta part !

Une dernière question, existe-t-il un endroit où on peut trouver des qcm assez précis (genre par chapitre) en Bioch ? J'ai téléchargé les qcm qui sont sur le forum mais ils sont vraiment sur tout le programme et je ne peux donc pas m'entraîner sur une partie spécialement.

Peut-être existe-t-il un livre en rapport avec le programme de Bioch qui fournit pas mal de qcm ?

[marquito]

Les Qcms que tu peux trouver sont soit des annales (donc des annathèmes, les miennes étaient classer par thème) soit d'anciens tutorats où même pourquoi pas tes propres QCMs que tu rédiges quand tu connais bien ton cours et que tu refais 1 semaine après.

[Dawn]

Salut!

Juste pour savoir, le pHi, c'est bien le pH à l'équivalence non ??

[marquito]

Salut!
pHi = pH isoélectrique c-a-d quand ton AA a une charge neutre

A bientôt

[Dawn]

Merci =)