introduction de molécules fluo dans la cellules

[kitty]

bonjour !!

jai plusieurs questions concernant la façon dont on rend fluorescente une cellule ou une protéine particulière :

- quand le prof parle des techniques de microinjection, electroporation et vectorisation par vésicules, est-ce qu'on injecte juste une molécule de GFP (et ds ce cas on a une coloration de la cellule en entier) ou est-ce qu'on injecte une protéine d'interet a laquelle on a déja greffé la GFP (et ds ce cas c'est pour étudier exclusivement la protéine)

- est ce que DAPI et Hoescht se fixent sur A et T séparément (cad peuvent se fixer soit sur A soit sur T) ou est-ce qu'ils se fixent sur la liaison A-T (se fixent à la fois sur A et à la fois sur T)
et s'ils se fixent sur A et T en meme temps, comment fait-on pour marquer l'ARN ?

- le prof parle plus loin d'anti-corps anti-ADN qui ne reconnaissent pas une séquence d'ADN mais une conformation, qu'est ce qu'on entend par conformation ?

- QCM 6 tut rentrée item A
"dénaturation obligatoire dans le FISH" la réponse était faux parce qu'il n'y a pas de dénaturation sur l'ARN qui est simple brin
mais pour avoir de l'ARN il faut passer par l'ADN nn ? donc ya quand meme dénaturation meme si ça ne se fait pas sur l'ARN a proprement parlé ?

merci d'avance !!

[Ondine]

Salut !
- Pour les techniques d'introduction dans la cellule, c'est super général, ça regroupe un peu tout, que ce soit de l'ADN, des protéines marquées, de la GFP seule etc
- Pour le DAPI, honnêtement ... On s'en fou ! xD Ce qui compte c'est de savoir que ça colore l'ADN, et puis, que ça se fixe aux bases A et T à la limite ... mais c'est tout ce qu'on te demande !
- Ce qui est important de retenir c'est que les anticorps ne peuvent PAS reconnaitre UN GENE ! Avant on croyait qu'ils ne pouvaient pas reconnaitre une succession de nucléotides, puis après on s'est rendus compte qu'ils pouvaient (mais genre un tout petit truc comme TTAGGG (télomères) mais jamais un gène entier.
- Pour le QCM de Tut rentrée, non l'ARN se ballade simple brin dans le cytoplasme, donc pas besoin de le dénaturer, quand on envoie notre sonde (simple brin) elle va aller s'hybrider avec notre petit ARN. (je sais pas si j'ai bien compris le sens de ta question en fait) !

Désolée si je réponds approximativement à tes questions, mais faut pas que tu te prennes la tête avec des micro-détails !

@+ Travaille bien !

[-Alexis]

Salut kitty ! (dis donc tu t'es fait un kiff soirée biocell on dirait ! )

-on peut faire absolument les deux !

-DAPI et Hoscht se fixent sur A et T séparément. A chaque fois qu'ils trouvent un A il s'y fixent et à chaque fois qu'ils trouvent un T, ils s'y fixent ! (Donc pas de problèmes pour l'ARN)

-Gilson dit "certains Ac peuvent reconnaitre des acides nucléiques et certaines conformations d'acides nucléiques. Ce sont les Ac anti-ADN." En fait ton ADN va avoir différents structures tridimensionnelles suivant les protéines de structures qui sont autour de lui. C'est ces structures spécifiques que Gilson évoque avec ses "conformations". Ensuite il dit "mais ces Ac ne sont pas capables de reconnaître une séquence spécique d'acides nucléiques". En gros on n'a pas d'Ac qui sont spécifiques à un gène complet. Du coup on utilise le FISH !

-Alors là tu mélanges un peu tout, attention. Prenons une cellule normale, vivante, à un instant T. Dans cette cellule y'aura de l'ADN (dans le noyau), de l'ARN, et des protéines. Tout ca sera présent en même temps dans ta cellule.

Tu veux visualiser ton gène X au niveau de l'ADN : tu dénatures l'ADN (on ouvre l'hélice) et tu injectes ta sonde fluorescente. Ta sonde va venir se fixer (grâce au principe de la complémentarité des bases) à ton ADN. Il y a hybridation de la sonde fluorescente à l'ADN. Et là, tu regardes et tu peux suivre ton gène X sur l'ADN au microscope. Si plus tard ton ADN est transcrit, l'ARN ne sera pas fluorescent puisque ta sonde elle est fixée à l'ADN.

Tu veux visualiser ton gène X au niveau de l'ARN : tu injectes directement ta sonde fluorescente qui va naturellement s'hybrider avec l'ARN (toujours grâce à la complémentarité des bases). Tu peux faire ça sans dénaturation car l'ARN est simple brin. Et là tu visualises au microscope ton gène X sur l'ARN.

Voilà, j'espère que c'est tout bon ! A bientôt !

EDIT : on a répondu en même temps avec Ondine, je te laisse quand même ma réponse.