Immunoflorescence indirecte

[Weegun]

Salut à tous,
j'ai une question qui me trotte dans la tête depuis un petit moment, la réponse est surement évidente mais je la trouve pas ^^ dans l'immunofluorescence indirecte on cherche à localiser une protéine sur laquelle on fixe d'abord un anticorps primaire sans rien de spécial dessus et ma question c'est pourquoi est ce qu'on fixe pas directement le fluorochrome ou le marquer à l'or sur cet anticorps primaire plutôt que d'avoir recours à un anticorps secondaire qui va se fixer sur le premier.
Par ce qu'au final si on met le marqueur sur le primaire, il go se fixer sur la protéine et hop elle est localisée non ?

[Ondine]

Salut ! Ta question n'est pas bête du tout, et en fait, tu auras en partie la réponse dans la prochaine ronéo de BioCell (la mienne hihi)

En fait ce dont il faut bien se rappeler, c'est que les anticorps primaires SONT PRODUITS PAR LES LYMPHOCYTES D'UN ANIMAL !
Tu injectes l'antigène, et les anticorps sont produits par les défenses immunitaires de ton animal. Donc, si jamais tu trouves un animal qui arrivent à produire des anticorps directement fluorescents .... APPELLE GILSON ILLICO !
C'est pour ça qu'on est obligé d'acheter des anticorps secondaires (qui sont génériques, qui s'achêtent dans des catalogues) qui eux ont été rendus fluorescents artificiellement.

Ce qui est important :
- Les anticorps primaires sont spécifique de ton antigène (ou plutôt d'un épitope de ton antigène, cf. Ronéo 2)
- Les anticorps secondaires sont seulement spécifique d'une espèce !

Voilouuuu.
Bientôt le premier tutorat, je sens l'excitation générale monter, c'est boooonnnn çaaaa

[Weegun]

D'accord, en fait je pensais qu'on était capable de fixer le fluorochrome directement sur l'anticorps "naturel" (un peu comme on le fait avec les cellules "normales" et c'est pour ça que je comprenais pas l’intérêt du passage par le secondaire ^^

Merci pour ta réponse ça fait plaisir de pouvoir compter sur votre aide

[-Alexis]

Salut salut !

Je rajoute aussi que c'est pour amplifier le signal. En fait tu vas par exemple avoir 3 Ac primaires sur ta protéine, et ensuite 3 Ac secondaires (couplés à un fluorochrome) par Ac primaires. Tu as multiplié ta fluorescence par 3 ! Voilà.

Ensuite je rejoins Ondine :
Bientôt le premier tutorat, je sens l'excitation générale monter, c'est boooonnnn çaaaa et je rajoute C'est boooonnnn çaaaaaa. Position 1, 2 ! Position 1,2 ! Mitraillette à gauche!! Mitraillette à droite !!

[Weegun]

Mdrrrr, ils sont fous ces tuteurs ^^

Je suis en train de ficher mes notes de cette semaine et j'ai vu que la protéine A se fixait à toutes les immunoglobulines donc (juste pour savoir =D ) est ce que vous pensez qu'il est possible de créer une protéine hybride protA-GFP (par expression des 2 séquences correspondantes misent bout à bout...) qui irait se fixer directement sur l'anticorps primaire ??

Même si j'imagine bien que ça couterait surement plus cher à cause de la manip génétique et qu'au final la fonction de la protéine A serait peut être altérée par la GFP

[-Alexis]

A priori ca pose pas de problème !