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Expérience LacI, sites de fixation lacI, VP 16 !


Expérience LacI, sites de fixation lacI, VP 16 !

Messagepar charlotte dllees » 12 Déc 2011, 15:21

Salutttttttt, :D

J'ai un petit problème sur l'expérience concernant les opérons lacions, en faite surtout la fin ! :?
Est-ce que quelqu'un peut m'expliquer ?
Je vous retranscrit à partir de quel moment j'ai pas capter ! (mes questions sont en rouge....)

"→ Donc dans le même cellule, on va faire exprimer un récepteur lactose → le gène Lacl pour lactose inhibiteur.
→ ce gène va être modifié de telle façon qu'il va coder pour une protéine Lacl fusionnée à deux éléments :
* une GFP pour permettre de la 'lire' dans le noyau
* et en fonction de l'expérience +/- un domaine de l'activation de la transcription pour tester l'effet du signal de ce FT sur les régions opérateurs
→ Sur une des cellules, on observe la présence de 256 opérons lactose à un endroit du gènome. On est donc dans une cellule qui n'exprime que l'hybride Lacl-GFP : il n' y a pas de VP16 J'ai pas très bien compris à quoi servait concrètement VP16
→ Sur une autre cellule, on voit que le noyau va exprimer GFP-Lacl-VP16. VP16 est un domaine d'activation de la transcription qui permet le regroupement des médiateurs. On voit que l'effet est dramatique a l'échelle du noyau  : on observe une complète ouverture, la fibre de chromatine est même en train de s'ouvrir. On voit les 256 opérateurs lactose à la queue-leu-leu qui s'ouvrent à l'intérieur du nucléoplasme. Pourquoi c'est dramatique ?
→ ceci prouve qu'un FT (VP16 ici) a la capacité de contrecarrer a chromatine hyper condensée. Ceci est une explication de la présence de FT parmi les protéines En(var) J'ai pas compris du coup la conclusion...


Désolée ce la question un peu à rallonge....

Bise et bonne soirée, Charlotte :wink:
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Re: Expérience LacI, sites de fixation lacI, VP 16 !

Messagepar -Alexis » 12 Déc 2011, 16:21

Salut Charlotte !

Bon alors déjà il faut comprendre pourquoi on fait cette expérience.
Jusqu'à maintenant qu'est-ce-qu'on savait des FT ?
Ils se fixent sur l'ADN pour permettre la transcription. Et basta, c'est tout, rien d'autre, nada, niet !

Ici on va montrer que les FT jouent aussi un autre rôle. Ils influent sur la structure de la chromatine. (Ca concorde avec leur fonction primaire. Ils sont censé favoriser la transcription. Donc ils peuvent le faire en se fixant sur l'ADN comme on le sait déjà, et là, on va montrer qu'ils peuvent aussi favoriser la transcription en "ouvrant", en décondensant la chromatine.

VP 16 est un FT.

On a introduit dans nos cellules un gène sur lequel LacI va se fixer.

1ère expérience :

LacI-GFP se fixe sur tous les sites de fixation LacI qui sont les uns à la suite des autres. On regarde au microscope et on voit que toute la fluorescence est concentrée au même endroit. L'ADN est condensé.

2ème expérience :

On couple un FT à notre LacI-GFP. Ce FT c'est VP16. On a donc un LacI-GFP-VP16.

Comme précédemment, notre protéine hybride va se fixer sur les sites de fixation LacI. Seulement, comme la protéine qu'on a "fabriquée" contient VP16, VP16 va agir et va décondenser l'ADN. Au microscope on voit de la fluorescence un peu partout ce qui prouve que l'ADN est décondensé.

Cette expérience a servi à montrer une nouvelle action des FT : ils sont capables de décondenser l'ADN !

Pourquoi c'est catastrophique ?



C'est catastrophique pour la pauvre cellule de notre expérience parce qu'on lui a décondensé son pauvre petit ADN qui n'aurait pas dû être décondensé ! Et oui, Gilson sait être très compatissant envers les cellules ! :lol: :lol:

J'espère que c'est plus clair.
A bientôt et bon courage !
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Re: Expérience LacI, sites de fixation lacI, VP 16 !

Messagepar charlotte dllees » 12 Déc 2011, 16:43

AH, MERCCCCCI!!!!
J'ai compris... hihi :P

J'ai un autre truk qui me tracas :
(Je tiens a préciser, que tu n'est pas obliger de répondre maintenant toute suite, parce que je suis relou avec mes longues questions...)

IMMUNOPRECIPITATION DE LA CHROMATINE
objectif : de savoir quel type de nucléosome est présent a quel endroit du génome.
1. On part d'une cellule (pas ADN) et on fige la cellule on ponte avec des agents bivalents (formaldehyde). Réversible en modifiant le T°
2. on peut ensuite fragmenter et purifier la chromatine. On obtient des fragments de chromatine. Les nucléosomes sont différents.
3. Outil principal de cette machine : générer des A.C capable de reconnaître spécifiquement chacune de ces modifications. → on enrichie les fragments qui ns intéresse.
4. (Pour visualiser de quel ADN il s'agit). On reverse le pontage c'est quoi un pontage ? et on purifie ADN. On rearque que L'ADN est de compo différentes comparé à l'ADN contrôle (InPut). Ce qui a été enrichi ce sont les fragments d'ADN qui ont la modification recherchée sur les nucléosomes.j'ai pas compris cette phrase
ATTENTION : on sélectionne de L'ADN A PARTIR DE MODIFICATION DES NUCLEOSOMES sinon quoi ? . On sélectionne la modif nucleosomale qu'on veut et à partir de ca on récupère l'ADN qui a de la chromatine qui porte cette modification.


Comment visualiser cet ADN
- par hybridation : on regarde si la sonde est enrichie dans l'immunoprécipitation par rapport à l'input ca c'est ok
- par la réaction PCR : permet de déterminer très précisément la quantité d'ADN enrichit. Ceci implique la connaissance du gène qui nous intéresse. ca aussi
- avec des machines de séquençage. Méthode du Chip-sec. On exprime le rapport Rip ca un peu moins... lol
Rip = quantité de fragment PCR qui nous intersse dans l'IMMUNOPRECIPITAT / quantité totale d'ADN. Plus ADN est repandue plus le rapport est grand.
Rc : Q fragments PCR qui nous interesse ( LA MEME) dans l'input / Q totale d'ADN
ENRICHISSEMENT SI RIP>Rc
→ on parle d'un facteur d'enrichossement = Rip/RC

L'application de cette technique : région B-globine récepteur folate.

Il y a une corrélation quasi parfaite entre l'enrichissement en K4 acétylé sur H3 sur les gènes qui s'expriment et une chute brutale au niveau des insulateurs. Les domaines bornés par les insulateurs sont superposés par des domaines avec des diversités d'H différents. pas compris la chute ...


En tous ca MERCI POUR TOUT, ET DESOLÉE de te pendre de ton temps de travail...
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Re: Expérience LacI, sites de fixation lacI, VP 16 !

Messagepar -Alexis » 12 Déc 2011, 16:51

Salut ! Alors je n'ai pas lu ton long post ! ^^

Mais ! Ondine a déjà fait une très jolie explication sur l'immunoprécipitation, je ne sais pas si tu l'as vue. :arrow: viewtopic.php?f=226&t=17562&p=128065#p125285

Si ça te pose encore soucis après ça reviens le dire ici !
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Re: Expérience LacI, sites de fixation lacI, VP 16 !

Messagepar charlotte dllees » 12 Déc 2011, 17:30

Ouin après avoir chercher un peu je l'avais trouver!
Trop forte cette Ondine !

Bonne soirée :)
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Re: Expérience LacI, sites de fixation lacI, VP 16 !

Messagepar -Alexis » 12 Déc 2011, 18:49

Donc c'est bon, c'est compris ?
Ou alors tu avais déjà trouvé ce post avant de poser ta question et tu veux toujours une réponse ?
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Re: Expérience LacI, sites de fixation lacI, VP 16 !

Messagepar charlotte dllees » 12 Déc 2011, 20:38

Juste ça :

Il y a une corrélation quasi parfaite entre l'enrichissement en K4 acétylé sur H3 sur les gènes qui s'expriment et une chute brutale au niveau des insulateurs. Les domaines bornés par les insulateurs sont superposés par des domaines avec des diversités d'H différents.

Pleaseeeeee :)
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Re: Expérience LacI, sites de fixation lacI, VP 16 !

Messagepar -Alexis » 12 Déc 2011, 21:17

Ce sera pour plus tard, je ne connais pas trop ce cours... :mrgreen:
Et puis peut-être que Gilson redétaillera l'immunoprécipitation durant la séance de révision !
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