déphosphorylation avant ligation

[germaine]

bonjour,
je voudrais demander au tuteur pour savoir quand est-ce que la méthode de déphosphorylation est nécessaire avant la ligation car sur le poly il est écrit que c'est nécessaire pour les extrêmités franches, mais il me semble qu'elle a dit en cours que 2 extrêmités cohésives peuvent aussi se lier sans insert....
please HELP

[Dawn]

Coucou !

Je ne suis pas tutrice mais je peux peut être t'aider:

2 extrêmités cohésives peuvent aussi se lier sans insert....

Sur quel diapo as tu vu cela ?? ( l'as tu vu ?)

D'après moi seul les plasmides (vecteurs) aux extrémités franches peuvent se refermer sur eux même sans insert.
Donc pour moi cette méthode de déphosporylation s'applique uniquement (dans le cours du moins) aux plasmides présentant des extrémités franches, pour enlever leur complémentarité des extrémités entres elles (P-OH OH-OH) et empêcher qu'il ne se referme sur lui même sans insert.

Voilou j'espère que ça t'aide et que c'est correct

[kelis]

+1 DAWN !

[germaine]

merci beaucoup!!!!!!

[Dawn]

De rien

[gabriel]

c'est juste!!!si la déphosphorylation est efficace à 100%, tous les clones bactériens capables de se multiplier sur milieu sélectif auront intégré un insert

[attention83]

Bonjour,

En cours il me semble avoir compris comme germaine.
D'apres ce que j'ai compris du cours, on utilise la déphosphorylation dans les cas où on a deux extrémités de même type :
-franche/franche
-cohésive/cohésive

Car apparemment si on ne déphosphoryle pas, cela à plutôt tendance à "se refermer" et donc on aura plus de plasmide sans l'insert que de plasmide avec l'insert.
Ce que j'ai compris, c'est qu'elle insistait sur le fait que ca peut ça a plus de chance de se "ré-imbriquer" que d'inserer une séquence.

Et donc si on a une extrémité franche avec une extrémité cohésive, cela n'a pas tendance à "se refermer" sur lui meme, et par conséquent on a pas besoin de déphosphoryler préalablement.

Des explications ?

Merci d'avance.
Bonne journée.

[Dawn]

Coucou !

Un vecteur ayant 2 bords cohésives, ne peux se refermer sur lui même si c'est comme l'exemple du cours
Illustration:
Si les sites de restrictions sont les mêmes :
GIAATTC[...]GIAATTC
CTTAAIG[...]CTTAAIG
après digestion
AATTC[...]G
-----G[...]CTTAA
--> ton vecteur aura effectivement les bouts compatibles
AATT (en haut à droite)
TTAA(en bas à gauche)
Edit: donc ce qui est digéré dans mon illustration c'est bien entendu l'insert --> avec les 2 sites de restrictions identiques
notre vecteur après digestion sera compatible avec l'insert mais aussi du coup avec lui même --> possibilité de se refermer sur lui même.

Mais lorsque l'enzyme de restriction coupe, les deux bords simple brin ne sont pas forcément compatibles entre eux ils sont identiques --> si ne sont pas donc compatibles entre eux ou alors ils différents --> toujours pas compatibles c'est par rapport à ce que je me souviens : une enzyme de restriction coupe entre deux bases genre Eco RI entre (G et A) et (A et G) et Taq I entre (T et C) et (C et T)
De plus comme on coupe en deux endroit avec notre enzyme --> il n'y a pas forcément la même séquence entre nos GA.
Illustration:
GIAAACGTC[...]GIAATTC
CTTTGCAIG[...]CTTAAIG
après digestion
AAACGTC[...]G
-------G[...]CTTAA
--> si les bouts de ton vecteurs sont coupés pour être compatible avec cet insert il ne pourra se refermer sur lui même.
Edit: c'est toujours l'insert que je digère dans l'illustration et ici après digestion, le vecteur sera compatible avec l'insert mais plus avec lui-même
Mais là j'ai pris l'exemple de s'il on a 2 sites restrictions différents (la séquence au milieux change), alors je ne sais pas si c'est fait en vrai ou si c'est fréquent ...

Pour la déphosphoration, en cours elle ne nous en a parlé que pour les bords restrictifs.
bords restrictifs ???? qu'est ce que j'ai voulu dire là ?? bords francs ^^

J'espère que ça t'aide que c'est correct et que c'est un peu clair
Voilou

[attention83]

Je n'ai pas bien compris ton message mais il me semble que la prof ait précisé que c'est faisable pour les deux

[Dawn]

Désolée

D'après moi, le déphosphoration est utilisée chez pour les vecteurs présentant des bord francs car le fait de se refermer sur lui même consiste à coller entres elles des bases "du même simple brin" par leur P et leur OH d'où l'utilisation de la déphosphorylation.
Alors que refermer sur lui même un vecteur présentant des bords cohésifs consiste d'abord (surtout) à reformer des liaisons hydrogènes entre bases complémentaires et après à former les ponts phosphodièstères.
Dans le cours il me semble que la prof est dit que la technique de déphospho. s'appliquait lorsqu'il y avait des bords francs.

Et sur la diapo "Déphosphorylation" il y a marqué :
"Une étape de déphosphorylation est nécessaire avant la ligation de fragments d’ADN clivés par des d’enzymes de restriction qui génèrent des extrémités franches."


[attention83]

Merci de prendre la peine de réexpliquer c'est super sympa de ta part.
La j'ai mieux compris ton truc et effectivement ca parait logique.
Mais j'ai réécouté l'enregistrement et à un moment elle dit ca, j'essaye de le découper et de mettre ca en ligne pour que tu entendes.

[Dawn]

De rien
Okay ça marche j'attends alors.

PS: je vais édité mon message parce que c'est vrai c'est un peu beaucoup ? "embrouillant"

[attention83]

Voici le fichier vidéo avec des le debut de la partie
et la partie compromettante à 2min

[Dawn]

Ah oui je vois :
en faite elle dit que quand on est dans le cas de figure où l'on a 2 extrémités franches, il y a une étape supplémentaire à faire car les 2 bords sont compatibles et qu'ils peuvent se refermer sur eux mêmes.
Ensuite elle dit, avant d'énoncer le principe de déphospho, que quand on a un bord franc et un bord cohésif --> ça ne peut pas se fermer sans insert mais qu'aussi dans le cas où l'on a 2 extrémités cohésives(= citation: "là encore ici aussi"), le vecteur peut se refermer sur lui même et à ce moment elle dit que l'on veut favoriser la phénomène "vecteur+insert" par rapport à "vecteur tout seul" ==> "afin que la ligase ne puisse pas majoritairement refermer le vecteur sans y avoir mis l'insert, on ajoute une étape supplémentaire qui est la déphosphorylation" puis elle énonce le principe
on peut donc comprendre que la déphospho s'applique aussi lorsque l'on a 2 bords cohésifs

et si on ne garde que cette partie ça ne s'applique que dans le cas où l'on a 2 bors francs cf. la diapositive et la phrase cité dans l'un de mes posts précédant

C'est ça ???

OU il faut comprendre que lorsque les extrémités sont compatibles il y a cette étape de déphospho ?

[attention83]

Je pense que un tuteur devrait passer nous éclairer ^^

[gabriel]

pour la ligation...plusieurs possibilites car les enzymes de restriction peuvent couper en laissant des bouts cohésifs ou francs...
-si on a des bouts cohesifs des 2 cotés: les bouts cohésifs du vecteur vont sh'ybrider a ceux de l'insert
-si l'enzyme a laissé d'un coté de l'insert une extremité a bout franc et de l'autre coté cohésif; le bout cohésif va sh'ybrider avec celui du vecteur tandis que pour le bout franc une ligase va intervenir pour les lier ensemble
-si l'enzyme laisse que des bouts francs...le risque c'est que le vecteur se referme sans insert!!!on utilise donc une etape de déphosphorylation pour eviter que la ligase ne referme le vecteur sans insertt!!!
voila