exonucléase S1

[feryel]

salut, dans la première ronéo page 19, on dit que les exonucléases ont une activité 5'-3', car les brin sortants sont en 5' mais si les brins sortants étaient en 3'...comment fait ont?? et est-ce possible d'avoir des enzymes de restrictions qui nous donnent des brins sortant en 3'?? voilà mercii d'avance

[Ilan]

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[gabriel]

les bords sortant de l'insert sont des 2 cotés normalement pas seulement du coté 5' ("car les brin sortants sont en 5' " j'ai pas cette info moi): rappelle toi que des 2 cotés 5' et 3' on a 2 brins, un sortant et un pas ("rentrant"), donc on va grignoter celui qui sort avec une exonucléase ou combler avec une polymérase le brin rentrant.
NB: definition generale: L'exonucléase est une nucléase, une enzyme qui coupe les acide nucléiques (ADN ou ARN) à partir d'une extrémité, un nucléotide à la fois, et dans un sens 5' vers 3' ou l'inverse.
en effet il existe plusieurs types d'exonucleases:par exemple l'exonuclease S1 agit dans le sens 5'-3' ,mais il en existe d'autres comme l'exonucléase III qui hydrolyse des nucléotides d'un ADN double brin dans le sens 3'→5'.
mais bon ce qu'il faut retenir je crois c'est de façon generale: on peut parfois se retrouver à utiliser 2 enzymes différentes pour le vecteur et l’insert, conduisant à un vecteur à bords francs et un insert à bords cohésifs: dans ce cas on utilise des exonucléases ou des polymerases pour transformer les bords cohésifs en bords francs pour que la ligase puisse agir.

[gabriel]

juste pour eclaircir un truc: on a plusieurs cas de figures:
1-les enzymes de restriction laisse des bords cohésifs des 2 cotés de l'insert et du vecteur: hybridation des bords cohésifs du vecteur a ceux de l'insert
2-d'un coté une enzyme laisse des bords francs et de l'autre des bords cohésifs sur le vecteur et l'insert: les bords cohésifs vont s'hybrider entre eux et la ligase lie les bords francs du vecteur et insert entre eux
3-les enzymes laissent des bords francs des 2 cotés sur linsert et le vecteur: la on fait intervenir une etape de dephosphorylation (comme expliqué sur un autre post) pour eviter que le vecteur ne se referme sans insert avant de rajouter les inserts et la ligae.
4-dernier cas de figure (celui qui a fait l'objet de ta question): c'est si on a des bords cohésifs sur linsert pas exemple et des bords francs sur le vecteur: la on utilise polymerase et/ou exonuclease pour rendre tout franc pour que puisse agir la ligase (on se retrouve dans le meme cas de figure que la 3 avec les bords francs partout)