(OK) Puce à ADN Ronéo 4 p3

[chelsea]

Bonjour,

Je ne comprend pas bien le principe de la puce à ADN (malgré la super vidéo de l'expérience ).
On prend un ARN et on lui fait faire une transcriptase inverse pour avoir un ADNc
Mais après je ne comprend pas avoir quoi l'ADNc est censé s'hydrider pour donner de la fluorescence?

[Bittoucell]

Hello !

Avant de répondre à ta question, on récapitule :
--> Le but de la biopuce, c'est de voir quels gènes sont exprimés, selon les conditions expérimentales (ces conditions expérimentales tentant, généralement, de reproduire des conditions physiologiques ou pathologiques)

--> Seulement, petit "problème" : la biopuce ne permet pas de séquencer (=trouver chaque base avec l'ordre et le rang sur l'ADN). Elle emploie la comparaison par rapport aux conditions opposées à celle qu'on observe (en général).

--> Dans le cas de l'expérience de la ronéo de l'année précédente (et ce sera la même cette année ) on compare condition aérobie (avec diooxygène O2) et anaérobie (sans O2)

Expérience :
- on expose donc deux groupes de cellules à ces 2 conditions
- En prélevant ensuite leur ARNm (premier passage vers les prot et donc ce qui nous indiquera comment la cellule a réagi et DONC quels gènes furent exprimés pour survivre.
- Étape suivant : "fabriquer" l'ADNc à partir de l'ARNm. Point important : l'ADNc serait constitué de bases azotées couplées à des fluorochromes. / Dans l'expérience : vert pour l'aérobie et rouge pour l'anaérobie.
- On mélange les ADNc des deux cas dans un même tube à essai.

-Et là c'est l'étape charnière : On va utiliser LA BIOPUCE qui est constitués d'énormément de spot sur lesquels sont placés différentes séquences de gènes = de l'ADN (pas ADNc)

- On va mettre notre ADNc sur ces spots et on va, à chaque fois, en étudier 3 à la fois pour comparer et voir si l'ADNc s'exprime dans tous les cas, dans aucun cas, dans l'un oui et l'autre non

MAIS ALORS COMMENT FAIT-ON ? POURQUOI ÇA DOIT ÊTRE HYBRIDÉ CE FOUTU ADNc ?

--> Quand on incube notre ADNc avec la biopuce, il ne va s'hybrider qu'avec une séquence qui lui correspond, au niveau du spot sur lequel il se retrouve. = L'ADNc doit être complémentaire avec l'ADN du spot pour rester fixé. Sinon : "il glisse" et ne reste pas sur le spot.

--> DONC s'il ne s'hybride pas, pas d'ADNc et donc PAS DE FLUORESCENCE

Ai-je été clair ou est-ce un tas de mots jetés au hasard ?

[chelsea]

Non c'est très clair maintenant merci

[Pounia]

Bonjour ! Concernant la puce à ADN un détail me chiffonne : pourquoi mélanger nos ADNc issus des deux colonies alors qu'on est censé utiliser deux lames de verre a et b différentes pour faire l'hybridation et ensuite superposer les deux pour comparer les couleurs ?
Je ne comprends pas, si on mélange les ADNc, comment peut on déposer celui d'une colonie a sur la lame a et celui de la colonie b sur la lame b puisque tout est mélangé (logique) ?

Merci bien !

[-Alexis]

Salut Pounia !

Attention, tu n'utilises qu'une lame de verre et qu'une seule biopuce. Ce que tu superposes ce sont les images obtenues gr$ace au microscope.
D'abord tu mets ta biopuce et tu envoie du laser qui va te permettre de visualiser le vert. Ensuite, sur la même biopuce tu envoies un autre laser qui va te permettre de visualiser le rouge. Enfin, c'est l'ordinateur qui permet la superposition de ces 2 images !

All right ?

[Pounia]

Perfect ! J'avais pas du tout imaginé ça comme ça en fait. Merci beaucoup !

EDIT : euh, en fait il reste un détail , si jamais y a qu'une lame, et qu'on est dans le cas où nos DEUX ADNc s'expriment au niveau d'une séquence, bah ça va poser probleme vu qu'un des deux (le "premier arrivé") va s'hybrider à la sequence du spot, ne laissant alors plus "la place" à l'autre pour s'hybrider... :/

[Mika]

Alors en fait tout est prévu car sur ta "lame" tu vas avoir plusieurs séquences d'ADN identiques pour que justement dans le cas où les 2 ADNc sont présents (donc c'est que les gènes se sont exprimés) ils puissent s'hybrider et ainsi être allumé par notre microscope ensuite.

[Pounia]

Hmmm ! Plusieurs séquences identiques ! Quel système ingénieux. Merci, maintenant tout est clair !

[mosecica]

Bonsoir,

j'ai une petite question concernant la puce à ADN. Dans la ronéo de l'année passée elle est décrite comme une méthode d'étude de génome, et cette année on dit dans la ronéo qu'elle étudie le transcriptome. Je suis d'accord que dans la technique on étudie les ARNm, mais après on étudie aussi les gènes avec l'ADNc.
Donc, ma question: est-ce que avec cette méthode on peut étudier les deux? Le génome et le transcriptome?

Merci.

[Mika]

Salut, c'est une bonne question je trouve.
Alors en fait si tu connais le génome tu es d'accord que tu connais le transcriptome. Maintenant, l'inverse n'est pas vrai, car en connaissant le transcriptome, comme il y a des gènes qui ne s'expriment pas, tu ne pourras pas connaitre le génome.

La puce à ADN étudie le transcriptome grâce aux ADNc (qui sont le reflet des ARNm). En fait pour obtenir ces ADNc, tu vas des ARNm non plus vers les protéines, mais tu vue faire un "retour" à l'ADN. Sauf que ca ne correspond pas à l'ADN du génome, mais à la complémentarité du transcriptome.
Donc la puce à ADN "étudie" ou plutot reflète le transcriptome et non le génome qui lui est beaucoup plus grand que le transcriptome.
D'ac ?

[mosecica]

D'ac ! Merci beaucoup!