(OK) FRET et chevauchement des spectres

[Sherry]

Coucou,
Alors petit soucis avec le FRET intermoléculaire,qu'est ce qu'on entend par "chevauchement des spectres " ? Je croyais savoir ce que ça voulait dire,mais dans la ronéo 2 on dit qu'il y à un FRET alors que pour moi les spectres ne se chevauchent pas . Je vous met le passage :
" Pour CFP : On envoie de la lumière à 430 nm et on enregistre uniquement à 476 nm.
Pour YFP : excitation à 510 nm et enregistrement à 530 nm.
Cette fois on excite à 430 nm et on détecte de la lumière émise à 530 nm,on peut donc déduire qu'il y à eu transfert non radiatif (FRET) "

Voilà mon problème : en quoi les deux spectre se chevauchent ? La lumière d'émission de CFP (476) ne permet pas d'exciter YFP (510) non ?

[Choubi]

ALORAAAA

Quelques petites précisions , on parle de spectre qui se chevauchent dans un intervalle, tu as pas une seule longueur d'onde qui peut exciter mais un intervalle de longueur d'onde.
D'ailleurs je te remets le schéma de la roneo, tu as les spectres d'absorption et d'émission de CFP puis de YFP d'où les 4 courbes. La zone hachurée est la zone de chevauchement entre le spectre d'émission de CFP et d'absorption de YFP où tu vois que c'est possible de faire un FRET

photo cfp.pdf

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J'espère que c'est un peu plus claire, n'hésites pas si problème est

[Sherry]

D'accoooooord,je me suis un peu embrouillée sur ce chevauchement .
Merci !

[Camille240394]

Autre petite question, je n'ai pas compris pourquoi dans le FRET, si on envoit du bleu et qu'on obtient du vert il n'y a pas la présence de fret. Alors que si c'est du rouge oui... Merci ^^

[Choubi]

Je ne comprend pas trop ton message :/

En fait chaque molécule a une longueur d'onde d'excitation et d'absorption qui lui est propre
Par exemple la GFP qui absorbe dans le bleu et émet dans le vert
Mais la rhodamine c'est différent elle absorbe dans le vert et émet dans le rouge
La fluorescéine a les mêmes caractéristiques que la GFP, il existe aussi le YFP, CFP...

RAPPEL: les longueurs d'onde correspondent à des couleurs

Prenons l'exemple du FRET donné à la tut rentrée entre une protéine-GFP et une protéine-rhodamine
Les 2 conditions du FRET sont:
- une distance entre les deux fluorochromes inférieure à 10 nm
- que le spectre d'émission de la première molécule chevauche le spectre d'absorption ou d'excitation de la deuxième

Pour "exciter" ta première molécule tu envoies de la lumière donc pour exciter ta prot-GFP tu envoies du bleu et elle réémet du vert donc tu devrais en théorie voir de la lumière verte
MAIS il peut y avoir FRET avec ta deuxième protéine-rhodamine si les deux conditions sont respectées, en l'occurrence tu vois bien que les spectres se chevauchent vu que la longueur d'onde d'émission de la prot-GFP correspond à ta longueur d'onde d'excitation de ta prot-rhodamine donc si les deux protéines sont à moins de 10 nm il va y avoir un transfert non radiatif entre les deux qui fait que tu ne vois plus le vert émis par la GFP il est directement "capté" par ta protéine-rhodamine qui elle réemet de la fluorescence rouge tu n'observes donc que du rouge
Si les conditions du FRET n'avaient pas été respectées soit au niveau des spectres soit au niveau de la distance, tu n'aurais vu qu'une fluorescence verte car elle n'aurait pas pu être "capté" par l'autre molécule

C'est plus claire ou toujours pas? N'hésites pas

[Camille240394]

Ah oui merci beaucoup plus clair, je n'avais pas du tout compris ça ^^ merci