(Résolu) transfection définitive par recombinaison homologue

[♦MC♦]

Salut, je ne comprends pas cette phrase dans la ronéo de l'année dernière (n°5) p4 :

"En fait ce qui va s'intégrer dans le noyau c'est vraiment un concaténer. C'est important de le savoir parce que souvent notre transgène ne va pas exister en disposition unique, surtout lors d'évènements de recombinaisons génétiques. Ce sera souvent en tandems. C'est-à-dire que le gène va être intégré plusieurs fois et les copies se suivant les unes après les autres en tandems."


Ce que je pense avoir compris : on peut introduire notre transgène de deux façons, soit on met sur un même ADN le gène puromycine, et le gène hybride entre la synthèse d'actine et de GFP, soit on introduit les gènes séparément mais de toute façon ils vont s'agréger entre eux au sein du noyau ( ça sera comme la première méthode donc ?) sous forme de concaténer = tandem (les deux gènes se suivent). C'est bon ?

Ce que je n'ai pas compris : Pourquoi on que le gène va être intégré plusieurs fois ? Que veut dire cette phrase "C'est-à-dire que le gène va être intégré plusieurs fois et les copies se suivant les unes après les autres en tandems" ?

PS : J'en profite pour demander aussi si lors de l'expression d'un gène, il donne plusieurs arnm et chaque arnm va donner plusieurs protéines ?

PS2 : Le gène Puromycine intégré au sein de 2 séquences d'ADN homologues aux extrêmités du gène sauvage, est-il obligatoirement intégré au niveau du gène sauvage (j'ai vu qu'il y avait 1 chance sur 1000000 je crois) ? donc en gros c'est soit il n'a pas d'intégration définitive soit il est intégré définitivement, et s'il est intégré définitivement, c'est obligatoirement à l'endroit que l'on souhaite ?

[Bittoucell]

Alors alors. (Tu as le don de poser des question très chiante ^^ c'est BIEN)

- Tu as compris. En effet, on peut : soit créer le gène actine-GFP-Puro soit faire actine-GFP + Puro puis intégrer pour au final obtenir notre protéine actine-GFP-puro.

- Dans le cas où on le fait de manière séparée, au final, oui, il s'associe au sein de la cellule formant un concaténer (= sur la même chaine : l'étymologie c'est utile parfois) et c'est pour cela qu'on peut employer cette technique pour faire la sélection à la puromycine.

- ce que tu n'as pas compris : En fait concaténer ≠ tandem. tandem = le fait que le gène va s'intégrer plusieurs fois d'affilé dans le noyau. Il n'y aura pas qu'une seule version de lui-même. Pourquoi ? bah ça arrive très souvent en transgénèse et surtout en recombinaison génétique... je ne saurais te donner la raison moléculaire mais on en a tellement rien à foutre que ça en devient DINGUE ! .

Parti Socialiste (PS) : C'est assez important de l'avoir en tête : un gène Plusieurs ARN / un ARN plusieurs Protéines. Si on avait une protéine pour un gène, on serait grandement dans la merde

PlayStation2 (PS2) : Oui, on a soit l'intégration définitive dans le génome, soit fuck off : pas d'intégration. C'est le principe de cette technique. MAIS ce n'est pas forcément à l'endroit où l'on souhaite. Il arrive souvent (et c'est le cas ici) qu'on se trouve avec une intégration au hasard et non pas ciblée.
Mais vue qu'on fout le gène qui nous intéresse (actine) + celui qui nous permet de le voir (GFP) + celui qui nous permet d'être sûr qu'il est intégré (Puro) du coup, on s'en fiche

[-Alexis]

Salut salut !

Je te copie-colle un post que j'avais fait l'an dernier là-dessus. Si ça ne répond toujours pas à ta question rédemande !

" alors déjà il y a une petite erreur de plan dans ma ronéo. Disons que je n'ai pas très bien séparé les parties et j'en suis désolé.

En fait, si on regarde bien les diapos de Gilson, il commence par parler de la recombinaison illégitime, puis ensuite il parle de la recombinaison homologue. Jusque là pas de soucis, le problème c'est que après, sans prévenir il développe l'exemple de l'act-GFP qui se fait "généralement, par intégration au hasard" (diapo bas de la page 3 de la ronéo.

Le truc avec les concaténer il n'en avait pas parlé l'an dernier et cette année il n'avait pas de diapos pou rillustrés son propos du coup c'était un peu fouilli

Je vais essayer de te démêler tout ça : si on intègre nos 2 transgènes (un pour l'act-GFP, l'autre pour la puromycine) par électroporation ou vectorisation par vésicule, il est possible que plusieurs de ces transgènes rentrent dans la même cellule.
Par ailleurs une fois dans la cellule ils vont tous se réassocier ensembles (act-GFP+PURO d'abord, puis actGFP-PURO + act-GFP-PURO ensuite, sous forme de tandems. Les mécanismes et le pourquoi du comment ne sont pas expliqués par Gilson, toujours est-il que ça se passe comme ça. Ensuite la séquence va être intégrée (au hasard) sous forme de tandems ou de concaténer dans le génôme.

Je ne pense pas que cette partie soit très importante, Gilson n'en avait pas parlé l'an dernier, n'y a pas consacré de diapo cette année et en plus il a un peu baclé son explication..."

[-Alexis]

Oups, Bittoucell est allé plus vite que moi ! Son explication a l'air mieux, y'a des couleurs et tout, garde-là ! ^^

@ Bittoucell => Attention je vais me fâcher, c'est mon jour de forum aujourd'hui ! gnark gnark ! :p

[♦MC♦]

Merci Bittoucell, merci Alexis. Pour info, mes questions sont toujours chiantes par définition

Alors pour l'introduction définitive du gène, tu m'as dit (Bitoucell) que soit c'est intégré dans le génome mais pas forcément où l'on veut, soit c'est transitoire...ce que je capte pas alors, c'est lorsque l'on veut Knock Out un gène (j'adore ce mot ^^) avec la Puromycine. Si j'ai bien compris, même si l'on a de part et d'autre de la puromycine les séquences présentes aussi de part et d'autre du gène à Knock Out, ben la recombinaison pourra quand même être illégitime ...mais alors comment on fait pour retrouver les cellules où notre gène est bien Knock Out, car la puromycine peut quand même s'exprimer n'importe où (et même si on a GFP sur actine, cela ne signifie pas que l'on a recombinaison homologue) !

[Bittoucell]

Ah non, pour le KO, on est obligatoirement en intégration ciblée, sinon on se retrouverait à mettre KO des gènes au hasard... Je parlais pour la transgénèse pour voir l'actine et tout

C'est mieux là ?

[♦MC♦]

Oui, je comprends de mieux en mieux. Donc, si on veut KO un gène on utilise que la puro par intégration définitive, toujours ciblée par recombinaison homologue sur les CSE, mais comment sait-on, dans la culture, si la puro est bien au niveau du gène que l'on cherche à Knock out, puisque j'ai vu que c'était très rare que ce soit le cas.

[Bittoucell]

En fait on fait tout pour que la séquence soit proche de la zone où on veut intégrer. Mais ça peut prendre des mois avant qu'on y parvienne ^^ ça donne envie d'être chercheur, hein ?

[♦MC♦]

Moi je veux être docteur House, c'est tout