QCM 15 CCB

[-Manon]

Hello

QCM 15 item A : dans l'immunoprécipitation la cellule est figée, mais ça implique pas qu'on la tue ?! Parce que j'ai toujours compris ça comme ça moi : elle est fixée donc ne peut plus interagir avec l'extérieur etc !

Merci !

[-Alexis]

Salut Manon !

Non, ces deux mots sont différents ! Dans la première étape de l'immunoprécipitation tu utilises du formaldéhyde pour former des liaisons covalentes protéines-protéines ou protéines-ADN. On dit qu'on effectue des pontages. Ca permet de conserver la structure des nucléosomes liés à l'ADN ! Ce pontage est ensuite réversé plus tard dans l'expérience pour dégrader les nucléosomes et récupérer l'ADN.

Voilà pour ce détail, à bientôt !

[GathGath]

Salut je rajoute mon petit truc.
Pour moi dans limmunoprecipitation on ponte puis on purifie la chromatine or purifier ce n'est pas récupéré que la chromatine et si on récupére que ça faut bien la lyser donc la tuer non ?
Merci d'avance de vos réponses.

[-Alexis]

Chromatine différent de ADN ! Chromatine = organisatino de l'ADN, tu as la fibre 11nm, la 30nm... Donc y'a encore les protéines !

[GathGath]

Oui ça je suis d'accord mais mon problème n'est pas la la chromatine c'est qu'on la purifie donc on enlève membrane plasmique , cytosol , et enveloppe nucléaire non ? Enfin pour moi purifier c'est ça donc pour faire ça on tue la cellule ? Bon après peut être que j'ai mal compris le protocole.

[Mika]

Salut, purifier la chromatine signifie ici que tu vas virer tous les nucléosomes

[GathGath]

Euh on purifie avant l'ajout d'Ac donc y aurait pas un problème si on vire les nucléosome ? Vu qu'on cherche les modif d'eux avec l'ADN associe ? Bon en tout cas si j'ai rien compris e veux bien une explication.

[Mika]

Je crois que tu confonds avec le mot pontage qui signifie que tu fige ta cellule à un moment donné. Comme si tu prenais une photo à un moment t.

C'est plus clair ?

[GathGath]

Bah la j'ai pas la ronéo a porté de main mais je me suis fais une fixe a partir d'elle et j'ai écrit pontage par formaldéhyde --> purification de la chromatine --> ajout d'Ac --> immunopreciputation --> enrichissement des portions ayant la modif voulu. Me suis je tromper quelque part ?

[-Alexis]

Bon allez, on va tout reprendre doucement parce que là ça vire au grand n'importe quoi

IMMUNOPRECIPITATION

1ère étape :

On fixe la cellule, on fait des pontage avec des agents bivalents. En gros ça veut dire qu'on stabilise, qu'on scelle, qu'on immortalise les liaisons protéine-protéine et les liaisons protéine-ADN. Donc en gros, ça fige les interactions entre les nucléosomes, l'ADN et les protéines autour de celui-ci.


2ème étape :

On fragmente la chromatine qui va être découpée en plusieurs morceaux. Attention, la chromatine est toujours attachées aux nucléosomes puisqu'on a fait les pontages durant la première étape.


3ème étape :

On purifie la chromatine. C''est à dire qu'on dégrade toute la cellule et tout ce qu'il y a dedans SAUF la chromatine qu'on va garder pour étudier. Donc bien sûr qu'à ce moment là on tue la cellule, mais ça en s'en contrefout au plus haut point puisque ce qu'on récupère (la chromatine) a été figé à un moment où la cellule était vivante et donc ce qu'on va étudier c'est en excellent état et parfaitement conservé !!
Rappel 1 : cette chromatine est composée de plusieurs petits fragments (voir étape 2 !)
Rappel 2 : cette chromatine est toujours associée aux nucléosomes (voir étape 1 !)

4ème étape :

On va à la pêche au nucléosome ! On prend un anticorps spécifique d'une modification d'histone. Par exemple un anticorps capable de reconnaître un H3K4 actylé sur un nucléosome.
Du coup, si sur un fragment d'ADN comportant 4 nucléosomes (comme sur la diapo du prof), au moins un de ceux-ci possède la lysine 4 (K4) de son histone H3 acétylé, on va "pêcher" tout le fragment (même si les 3 autres nucléosomes n'ont pas cette modification).

C'est ça l'immunoprécipitation : on a mis des Ac dans notre bouillie de fragments d'ADN, les fragments d'ADN qui possédaient la modification recherchée ont formé des complexes immuns avec nos Ac et ont précipité ! On a récupéré le précipita et on a jeté le reste de l'ADN. On dit que notre précipita c'est de l'ADN enrichi en nucléosomes comportant une acétylation de la lysine 4 (K4) de l'histone H3. Cet ADN est enrichi en H3K4 acétylé parce que dans cet ADN-là, il y a proportionnellement plus de H3K4 acétylé que dans un ADN complet. Je répète, on a enlevé tous les fragments sur lesquels il n'y avait AUCUN nucléosome comportant cette modification. Donc même si c'est pas parfait, on a fait un peu le ménage quand même.

Ici, la méthode pour enrichir c'était l'immunoprécipitation.

5ème étape :

On reverse le pontage. On chauffe, ce qui permet de supprimer les liaisons entre les protéines et l'ADN ! Donc là, on ne garde QUE l'ADN ! Ca va nous permettre de voir quelle région d'ADN comporte telle ou telle modification sur les nucléosomes qui lui était associés...

ET DONC, LA CONCLUSION DE TOUT CA :
C'est que l'item est moche, mal formulé, donc à la fois juste et faux et on va apporter ça dans les corrections, il sera compté à la fois juste et faux...
Désolé pour l'erreur

[GathGath]

Ok merci pour la belle explication ^^ je voulais pas ous manger autant de temps mais vraiment meri d'avoir pris le temps de me répondre avec autant de patience.

[-Manon]

Merci beaucoup Alexis pour ton explication, elle est au top, tout est clair dans ma tête maintenant !