Pathogénicité d'une mutation

[Joooh']

Re-Re Bonsoir

Dernier post promis

Voilà je n'ai pas bien compris le principe du clonage d'expression, des vecteurs d'expression etc : l'insert c'est toujours de l'ADN mais que l'on met dans un vecteur "spéciale cellule eucaryote", ce qui permet de l'incorporer à une cellule eucaryote et qui deviendra une protéine que l'on pourra suivre éventuellement ?

Pour créer une protéine fusion, la TAG, la petite étiquette que l'on colle, on la met sur la séquence d'ADN avant la transfection ou dans l'ADN quand il est dans la cellule ou lorsque la protéine est formée ? J'aurais dit sur l'ADN et pas sur la protéine mais dans la ronéo (de l'année dernière) il est écrit que les TAG sont des petites étiquettes qu'on colle en Nt ou Ct, donc est-ce que c'est vraiment sur la protéine formée qu'on les colle ou c'est un raccourci pour dire qu'on peut les mettre en amont ou aval du gène ?

D'ailleurs cette protéine fusion ne sert que si on veut étudier sa localisation non, par exple pour tout les "-Blot" on en a pas besoin ?

Ensuite je ne comprend pas concrètement comment ça peut aider à découvrir si un variant est pathogène ou non en étudiant de l'ADN et ARN (south et northenblot), parce que d'accord on verra une mutation mais rien de plus non ? Par expemle avec le westernblot je vois mieux, si lors de la migration la protéine est plus petite donc mal foutu c'est potentiellement la cause d'une pathologie, idem si elle est mal localisée, mais pour l'ADN et ARN je vois pas "d'exemple concret"...

Dernière promis promis, juste histoire de savoir si c'est tout clair parce que j'ai du mal à comprendre le plan de la ronéo sur cette partie, est-ce que dans l'ordre chronologique on a ça :
- préparation d'ADN recombinant vecteur d'expression-ADN du patient
- transfection dans la cellule eucariote
- exprimé, transcrit puis traduit, formant une protéine fusion si on avait mis une TAG
A partir de ça 3 niveaux d'études :
- soit expression de l'ADN -> southern
- soit expression de l'ARN -> nothern
- soit au niveau des protéines : expression des protéines -> western ou alors étude de localisation

Voilàààààà finiiiiiiiiiiiiii !!!!
Je suis vraiment vraiment désolée pour toutes ses questions, on pourrait croire que j'ai balancé toutes les questions que me venait, j'ai vraiment essayé de comprendre par moi même (ce qui a plus ou moins bien marché (plus mal que bien en fait ))
Gros gros merci d'avance là !

[Chob]

Voilà je n'ai pas bien compris le principe du clonage d'expression, des vecteurs d'expression etc : l'insert c'est toujours de l'ADN mais que l'on met dans un vecteur "spéciale cellule eucaryote", ce qui permet de l'incorporer à une cellule eucaryote et qui deviendra une protéine que l'on pourra suivre éventuellement ?

Voilà c'est ça !

Concernant la protéine de fusion, effectivement on ajoute une séquence en amont ou en aval du gène : la séquence ajoutée va correspondre au Tag de la protéine mais le tout (séquence + gène ) va être transcrit puis traduit en une seule protéine : protéine de fusion.
Si tu veux je pense qu'on parle de Tag comme succession d'acide aminé, càd qu'on parle de Tag une fois que la séquence en nucléotide qui le donne est traduit. Ca doit être pour ça que la prof dit qu'on "colle en Ct ou en Nt" (tyvoickejveudir ? )
Mais bon oui c'est un raccourci ..

Dans la ronéo tu verras c'est écrit :
tu as certaines protéines envers lesquelles tu as un AC qui permet de la suivre : tu fais un northern-Blot
puis tu as d'autres protéines envers lesquelles il n'y a pas d'AC par exemple: c'est pour ces protéines que tu vas utiliser les Tag et former des protéines de fusion


Le Northern-Blot, ça va par exemple te servir pour voir si dans un tissu particulier, tel ARN est exprimé ou non, beaucoup ou peu, si il est dégradé ..
Dans la ronéo 1, tu liras la partie "différence entre ADN et ARN" où est notée la phrase : L’ARN et donc l’étude qu’on veut en faire est différente d’un type cellulaire à l’autre puisqu’il est le reflet de la transcription de l’expression d’un gène.
Tu analyses l'expression de l'ARN dans un tissu particulier:
si la sonde utilisée arrive à retrouver son complémentaire, on voit un signal ((la sonde est marquée : signal radioactif, fluorescence .. ), c'est que l'ARN recherché est présent dans ce tissu
si la sonde utilisée ne trouve pas son complémentaire, c'est que l'ARN n'est pas présent dans ce tissu, ou alors c'est qu'il est dégradé etc.
plus le signal renvoyé est intense, plus l'ARN recherché est en grande quantité dans ce tissu
si le signal renvoyé par la sonde est très faible, alors l'ARN est peu présent

Puis tu peux par exemple comparer l'expression d'ARN dans plusieurs tissus !


Alors moi j'aurais dit :
- préparation d'ADN recombinant : vecteur d'expression + ADN du patient avec ou sans séquence traduit en Tag selon la protéine (avec si la protéine est difficilement reconnue ou non reconnu par un AC commercial / sans si on a un AC permettant de la repérer )
- transfection dans la cellule eucaryote
1/exprimé : étude de l'ADN qu'on va devoir extraire de la cellule = Southern-Blot
2/transcrit : étude de l'ARN qu'on va devoir extraire de l'a cellule = Norhern-Blot
3/traduit : étude des protéines qu'on va devoir extraire de la cellule = Western-Blot
ou
études des protéines dans la cellule par suivi du signal (fluorescent par exemple)

[Joooh']

OK parfait parfait c'est tout compris
Merci encore encore encore (je passe en résolu)