Ligation et déphosphorylation

[Avendil]

Salut ! (premiers message d'ue spé, grande émotion ^^)

Alors voilà je comprends pas un passage dans la ligation, on nous dit dans le diapo :

T4 DNA Ligase:
Enzyme qui catalyse la formation d’une liaison phosphodiester entre un 3’OH et un
5’Phosphate en présence d’ATP et d’ions divalents = liaison covalente entre deux molécules
d’ADN.

puis plus tard :

Une étape de déphosphorylation est nécessaire avant la ligation de fragments d’ADN clivés
par des d’enzymes de restriction qui génèrent des extrémités franches.

Et sur le schéma on voit que du coup il n'y a qu'un seul "étage" qui est lié P-OH vu que l'autre étage reste OH-OH.
Mais ce système n'est possible que dans le cas où notre insert a 2 extrémités franches ? Si il a une ou deux extrémintés cohésives, on doit forcément lier les deux brins ou peut on aussi en lier un en P-OH et laisser l'autre OH-OH ?

Voilà j'espère que je me suis pas embrouillé, et merci d'avance

[Kardajian]

Salut Avendil !

Merci de nous faire l'honneur de ton premier message en spé

I. Objectif de la déphosphorylation avant ligation

Elle est utilisé lorsque tu as une complémentarité entre les deux bords de ton vecteur. Le but est d’empêcher que le vecteur se referme sur lui même sans avoir intégrer l'insert

Tu peux avoir trois types de vecteur après action de l'enzyme de restriction :

- Deux bords francs (Déphosphorylation envisageable, c'est d'ailleurs dans cette situation qu'on le fait le plus souvent ^^)
- Un bord franc et un bord cohésif (Pas de déphosphorylation)
- Deux bords cohésifs (Déphosphorylation envisageable)

II. Principe et fonctionnement

On utilise une phosphatase qui va déphosphoryler les extrémités 5'-PO4^- du vecteur uniquement !

Cette étape nous permet d'obtenir :
- Dans le cas d’extrémités à bords francs :

Déphosphorylation bords francs.PNG (11.25 Kio) Vu 225 fois

- Dans le cas d’extrémités à bords cohésifs :

Déphosphorylation bords cohésifs.PNG (5.19 Kio) Vu 225 fois

On voit que dans les deux situations, la ligase ne pourra plus refermer le vecteur sur lui même. Néanmoins, elle pourra lier l'insert au vecteur au niveau des extrémités 3'-OH du vecteur

Cette étape nous permet d'obtenir :
- Dans le cas d'extrémités à bords francs :

Ligation vecteur insert.PNG (8.54 Kio) Vu 225 fois

- Dans le cas d'extrémités à bords cohésifs :

Ensuite, comme tu l'as dit, il y a l'autre "étage" qui reste -OH OH- sans pouvoir se lier. En fait c'est la machinerie de réparation de l'ADN de la bactérie qui va venir agir et réparer cette étage pour que l'on ait une ligation à ce niveau aussi

Est-ce que c'est plus clair ?

[Avendil]

La présentation est magnifique et l'explication parfaite ! Merci beaucoup Kardajian