Analyse Génétique - ARNm -> ARN

[Chloette]

Coucou !!

Alors j'ai un soucis avec la Reverse transciptase et la PCR..

Bon pour faire un petit résumé de la situation : notre soucis c'est qu'on cherche à lire un Exon inséré dans un Intron si j'ai bien compris.. et qui est apparut lors de l'épissage... et comme notre PCR ne va amplifier que les Exon sur de l'ADN (de base) elle ne va pas le lire.. d'où l'absence de figuration de la mutation dans les résultats.. Du coup notre solution : on va chercher a la visualiser sur un ARN. Pour ça on utilise la Reverse transcriptase (permet de passer d'un ARN --> ADN)

On nous dis dans la ronéo : << Il suffit d'une succession de T qui par complémentarité vont allez s'hybrider sur la queue polyadénylée des ARNm pour aboutir simplement à la copie ADN de notre ARN >>

Mais je ne comprend pas... On va recréer des introns ??
en fait je crois que je ne comprend pas très bien le passage d'un ARNm à un retour à l'ARN par un simple ajout d'oligo T pour les amorces sur la queue polyadénylée...

Merciii !!!

[Chloette]

Up!

[S'titchow]

Salut Chloette !! Ayant un peu des difficultés sur cette partie de la roneo aussi, je me suis penchée un peu plus sur le sujet pour essayer de comprendre, donc je vais essayer de t'expliquer ce que j'ai compris en espérant qu'une tutrice viendra pour confirmer/infirmer/reformuler ^^'

Ce que l'on sait :
Sur l'ADN génomique ( comportant exons + introns ), la PCR a pour but d'amplifier spécifiquement des portions exon+jonction exon/intron mais ne peut pas amplifier les introns.
Or, puisqu'on ne trouve pas notre mutation sur PCR de l'ADN génomique, on soupçonne celle ci de se trouver dans un intron qui aurait était malencontreusement transcrit en exon lors de l'épissage.

Partant de cette hypothèse, on va donc regarder si, sur notre ARNm, un variant ne serait pas apparu.
En faisant une extraction de l'ARNm, on se rend compte qu'effectivement un variant AG fait son apparition entre l'exon 6 et 7.
Normalement ce variant aurait dû être éliminé lors de l'épissage! Mais non!
Si on ne le voyait pas au départ en PCR c'est bien qu'il faisait partie d'un intron donc :
On assiste à la transformation INTRON -> EXON

Maintenant, pour voir si c'est bien CE variant AG qui est responsable de la mutation, il faut l'amplifier. Mais la PCR se faisant sur l'ADN, il va falloir produire un ADN complémentaire de notre ARNm en utilisant une reverse transcriptase!

Reverse transcriptase : ARN -> ADN, elle n'est pas spécifique d'un ARNm donné, par le simple fait qu'elle comporte une matrice d'oligoT lui permettant de reconnaître la queue PolyA de tout ARNm (donc pas besoins de primers) et de, par la suite, continuer son bout de chemin par complémentation.
On vient de former un ADN simple brin, complémentaire de notre ARNm.

Il reste simplement à amplifier par PCR notre variant au niveau de l'exon 6-7.

Voilà :3 comme je l'ai dis c'est ce que je pense, mais l'avis d'une tutrice serait parfait
J'espère au moins que j'ai pu t'éclairer sur certains points...
A bientôt

[Chloette]

Coucou S'titchow !!!

Merci pour ton post ! Je suis assez d'accord avec ton explication !

En fait je suis assez d'accord sur ton fameux --> INTRON DEVENU UN EXON .. Moi je ne l'avais pas compris comme ca. Je pensais plutôtqu'on avait eu un ajout d'exon dans l'intron (maintenant que je le dis ca me parfait absurde haha ! )

Je pense que tu as raisons et dans ce cas la je comprend mieux le passage de < complémentarité a l'ARNm > car sinon on aurait jamais eu vraiment lecture des introns

En tout cas je pense que c'est beaucoup plus claire maintenant

J'attendrais juste confirmation d'un tuteur à propos de ce fameux << Intron devenu exon >>
Et un petit recapitulatif pour le passage d'un ARNm a un ARN

Merciii

[S'titchow]

Il n'y a pas de quoi si j'ai pu t'aider c'est cool
Mais je ne vois pas trop quand est ce qu'il est dit dans le cours qu'on passe d'un ARNm à un ARN comme tu dis ? :/

[Gollume]

Hello

On nous dis dans la ronéo : << Il suffit d'une succession de T qui par complémentarité vont allez s'hybrider sur la queue polyadénylée des ARNm pour aboutir simplement à la copie ADN de notre ARN >>

Mais je ne comprend pas... On va recréer des introns ??
en fait je crois que je ne comprend pas très bien le passage d'un ARNm à un retour à l'ARN par un simple ajout d'oligo T pour les amorces sur la queue polyadénylée...

alors en fait tu ne passes pas d'un ARNm à un ARN.
La reverse transcriptase comme son nom l'indique tu vas faire l'inverse de la transcription. Donc tu passes d'un ARNm à un ADNc (c = complémentaire).
Le but c'est de repérer la mutation qui a eu lieu au moment de la maturation de l'ARN, qu'on a pas pu repérer par PCR classique sur l'ADN de départ.
( Pourquoi on a pas pu la repérer: parce qu'elle n'était pas présente sur la région exonique de l'ADN de départ (PCR: amplification des exons uniquement) )
De plus la PCR n'amplifie que l'ADN et non l'ARNm.
Donc pour repérer cette mutation invisible sur la 1ere PCR, on va partir de l'ADN complémentaire de l'ARNm, car comme son nom l'indique, cet ADN sera exactement complémentaire à l'ARNm, donc il reflètera exactement la succession nucléotidique de l'ARNm.
Donc si lors de la transcription, un bout d'intron se transforme en exon, l'ARNm sera + long que l'ADN de départ, donc forcément l'ADNc, sera lui aussi plus long que l'ADN de départ.
En faisant la PCR de l'ADNc, on trouvera la séquence nucléotidique qui a été rajouté par transformation INTRON > EXON !

Est ce que ca te va comme résumé?

Merciii !!!

En fait c'est un autre résumé que S'titchow t'a fait juste au dessus, et qui est très bien !
Juste retiens bien que grâce a la reverse transcriptase on passe d'un ARNm a un ADNc, pas d'un ARNm à un ARN!

Si ca va toujours pas, n'hésite pas!
Bon courage pour ce 2ème semestre

[S'titchow]

Merci pour la confirmation