Syndrome de Wolfram

[colango]

Kik,

Un petit soucis par rapport a la situation 2 (mutation père sur exon, pas pour la mère):

On nous dit que la mère a une mutation d'épissage, qu'un fragment d'intron se retrouve collé a un exon. Je ne comprend pas pourquoi quand on séquence normalement (sans savoir que c'est un soucis d'épissage) on ne s'en rend pas compte?

Je m'explique (j'essaie en tout cas):
Puisque le fragment d'intron est collé a l'exon, lors du séquençage on a un problème, c'est soit un morceau plus long (qui migre moins) ou au moins un morceau qu'on ne retrouve pas en temps normal non?

je ne comprend pas que "le seul moyen de voir ce type de mutation [soit] de travailler sur l'ARNm"

Merci

[Afroblacko]

Plop
En fait le problème est plus complexe que ça ^^
Souviens toi de la biomol quand l'on nous parlait de l'épissage, tu voyais qu'il y avait déjà des introns entre les exons mais qu'ils étaient clivés pour qu'au final notre ARNm ne comprenne plus que les exons.
Et d'ailleurs Naïmi avait à la suite de ça présenté les variations qui pouvaient aboutir a des sites cryptiques d'épissage, soit une rétention d'intron comme c'est le cas pour le syndrome de Wolfram.
Le soucis est donc que si tu séquences les exons ben tout est bon. La différence tu ne la verras que sur l'ARNm donc passage obligé par de l'ADNc pour te rendre compte que tu as un intron qui n'est pas parti parce qu'il était muté et a donc créé un site d'épissage alternatif ce qui a au final grossi l'ADNc
(ce que l'on voit sur le fragment) et permis la synthèse d'une protéine non fonctionnelle puisqu'il y a un fragment dans sa chaîne polypeptidique qui n'aurais jamais du être présent

[colango]

D'accord:

En gros, quand on séquence les exons, on ne voit vraiment que les exons? on ne voit même pas le petit bout d'intron qui est resté collé? il est digéré?
Ce que je ne comprend pas c'est que dans la cellule il est transcrit en ARNm

Attends je crois que j'ai capté un truc:

situation normale: mutation sur exon
fragment d'ADN on récupère uniquement les exons (comment?) séquencage on voit la mutation

situation relou : avec intron collant
fagment d'ADN on récupère les exons (digestion des introns y comprit le petit bout) séquencage tout est bon!
On revient en arrière ADN transcription a partir de l'ARNm on "reverse transcri" pour obtenir l'ADNc séquencage ah trop cool y a un bout bizarre!

Right?

[Gollume]

Salut

Alors il y'a quelques incompréhensions ici

Le message de Afroblacko est bon, tu peux le garder en tête colango

Je vais te faire un petit récap:

Il faut que tu comprennes déjà que la PCR est réalisée sur les EXONS(=séquences codantes du gène) au stade d'ADN.
Pourquoi?
les mutations introniques sont souvent silencieuses (j'y reviens)
les séquences codantes c'est moins de 5% du génome, donc amplifier les introns revient à passer sa vie dans un laboratoire lol

Dans quel cas on fait la PCR?
Pour amplifier une région génique d'intérêt.
A la suite de cette PCR on pourra réaliser un séquençage, pour connaitre la mutation.

Tu as donc bien compris que le syndrome de wolfram est une pathologie autosomique récessive.
Le pb c'est que lorsque tu fais une PCR-séquençage classique chez l'enfant atteint, tu ne trouve qu'une seule mutation, un seul allèle muté.
C'est pas normal parce que l'enfant est MALADE.
Si la mutation sur l'allèle 2 n'est pas au niveau des exons, elle est surement au niveau des introns.

je ne comprend pas que "le seul moyen de voir ce type de mutation [soit] de travailler sur l'ARNm"

parce que justement, jusqu'ici tu travaillais sur l'ADN.
Avec la PCR classique tu t'occupe du gène avant sa transcription.
La transcription de l'ADN en ARNm et sa maturation n'a pas eu lieu.
Or tu te rappelle, comme Afroblacko l'a dit: au cours de la maturation de l'ARNm et notamment de l'épissage (= suppression des introns), tu peux avoir une rétention d'intron, qui fait qu'une partie de l'intron ne va pas être éliminée et va "devenir" exon, ou du moins, une séquence codante, qui va donc être traduite en protéine.

situation relou : avec intron collant
fagment d'ADN on récupère les exons (digestion des introns y comprit le petit bout) séquencage tout est bon!

Alors non, tu n'amplifie pas les exons directement.
Pour déterminer la mutation de l'allèle 2, tu laisse l'ADN devenir ARNm et la maturation se dérouler.
De là tu obtiens uniquement une séquence codante. Elle correspond en fait à la suite d'exons de l'ADN initial + une partie de l'intron qui a "muté"

PROBLEME: tu ne peux pas travailler sur l'ARNm, tu ne peux pas l'amplifier directement par PCR.
SOLUTION: tu utilise la reverse transcriptase qui permet a l'ARNm de re-devenir de l'ADN, mais ici on parlera d'ADN complémentaire (ADNc)

Comparaison:
l'ADN initial fait la taille de la succesion d'exons du départ
l'ADN complémentaire fait la taille de la succession d'exons + le bout d'intron

On amplifie par PCR l'ADNc, et on le séquence. Grâce au séquencçage on détecte la nature de ce bout d'intron transformé en exon, qui correspond à la mutation de l'allèle 2.
Au final tu auras la nature des deux mutations nécessaires à rendre l'enfant malade !

Est ce que c'est mieux ?
N'hésite pas si besoin!
Bon courage

[colango]

Merci beaucoup, c'est vraiment cool!

Je reviens juste sur un truc, finalement, le fragment d'ADN normal et celui muté au niveau de l'intron sont exactement similaires avant des passer par l'ARN etc?

par exemple si on prenait ces deux fragments ca donnerait:

exactement les même fragments d'ADN
pré ARN exactement les mêmes
Maturation : cette fois ils sont différents et comme on peut pas se servir de l'arn pour le séquencage et les comparer direct, on passe par l'ADNc

Si c'est bon, j'ai compris! Merci

[Gollume]

Alors oui et non lol

Ce ne sont pas exactement les mêmes fragments d'ADN.
sur l'allèle 1, on a une mutation sur un exon : C-> A par exemple
sur l'allèle 2, on a une mutation sur un intron : T->C par exemple

Donc ils n'ont pas la même séquence nucléotidiques déjà.
En revanche ils ont la même taille.

Maintenant si tu amplifie par PCR le fragment d'ADN de l'allèle 1 + si tu amplifie par PCR le fragment d'ADNc de l'allèle 2
et que ensuite tu réalise une électrophorèse: l'ADNc de l'allèle 2 sera plus long que l'ADN initial de l'allèle 1, vu qu'un morceau d'intron de l'allèle 2 est devenu exon

Est ce que ca va ?

[colango]

Oui c'était une façon de parler! Parfait, merci beaucoup