New partie wtf ..

[gaelle.mi]

Coucou, alors j'ai un peu compris mais alors vraiment un tout petit peu la partie sur la derniere roneo av le NGS ..
J'arrive plus a partir du moment ou on amplifie par PCR en emulsion genre je vois pas a quoi servent les spheres enfaite
Si quelqu'un pzut m'aider
Merci ☺️

[chacha20122012]

Desole je peux pas t'aider

[Doomy]

Idem, cette nouvelle partie est un peu brouillon pour moi.. Serait il possible d'avoir une jolie fiche récapitulative ?

[A!ex]

+1

[nosleN]

Idem, j'ai absolument rien piger à partir de l'étape 2 d'amplification clonale par PCR en émulsion..

[pipoudii]

"Je suis pas toute seule"

[rurumime]

+1

[Frontalier]

Regardez ça : http://www.obs-banyuls.fr/genoval/flash ... ight=670Ca
Ca éclaircit déjà quelques points

[Sow~]

Coucou!


Alors, c'est une nouvelle partie pour nous aussi, donc je vais essayer de vous expliquer ça au mieux ^^'

Donc, en fait, une fois qu'on a préparé nos échantillons et isoler les séquences d'intérêt, on va vouloir les séquencer.
Sauf qu'à ce stade, on a pas encore suffisamment de matériel génétique pour faire directement le séquençage et aussi, tous les fragments d'intérêt sont mélangés. Donc le but ici, c'est d'abord de les séparer et de les amplifier par PCR.

Dans la technique de PCR en émulsion, on a un système de micro-réacteurs.
Dans un micro-réacteur, on a : une sphère, un unique fragment d'ADN, des primers (en 5' et en 3'), une ADN polymérase, des dNTP et un tampon.

Etapes :

1) Le premier primer P1 est complémentaire d'une région (en vert) du fragment d'intérêt -> Hybridation de l'amorce & Synthèse du brin complémentaire par la polymérase de 5' en 3'
2) On dénature pour obtenir à nouveau de l'ADN simple brin. Sur le brin synthétisé à l'étape 1, c'est le deuxième primer A (rouge & bleu) qui va venir se fixer -> Hybridation de l'amorce biotinylé
3) Synthèse du brin complémentaire par la polymérase de 5' en 3'

Là, à ce stade, on a l'impression d'avoir resynthétiser le même fragment d'ADN qu'au départ.
Sauf qu'il y a bien une différence : en comparant le fragment de départ (encadré en rouge) et le fragment d'ADN obtenu à la fin de l'étape 3 (encadré en bleu), on voit qu'il y a eu élongation d'une petite séquence supplémentaire (en rose). Cette séquence s'avère justement être complémentaire des primers qu'on retrouve sur la sphère.

4) Après une étape de dénaturation, notre fragment d'ADN va alors pouvoir s'hybrider à l'amorce de la sphère.
A chaque étape, les fragments nouvellement synthétisés sont fixés sur la sphère.
Et au bout de n cycles, on se retrouve alors avec une sphère recouverte d'un fragment PCR qui a été amplifié.

On veut maintenant récupérer que nos sphères avec l'ADN amplifié, on a donc une étape de purification par hybridation biotine/streptavidine.
Cette étape permet aussi d'éliminer les sphères sans ADN amplifié, donc non recouverts de biotine.

Comme sur chaque sphère on retrouve un même fragment d'ADN amplifié, on va pouvoir séquencer individuellement chacune de ces sphères -> Etape du séquençage avec la technique de variation du pH


Voilà, j'espère que c'est un peu plus clair! Si vous avez d'autres questions, n'hésitez pas!
Je suis en train de ficher ce cours, donc je vais essayer de vous sortir ça rapidement! ^^
Bonne soirée!

[pipoudii]

Merci Frontalier pour la video (topissime) et aussi à toi Sow pour ce recap d'enfer On attend la fiche avec impatience

[gaelle.mi]

Merci bcp pour ce recap !

[Doomy]

Merci !!

[MiniPfiou']

Explication top merci

[A!ex]

Merci Sow